用于CRISPR基因组编辑的修饰的指导RNA制造技术

提供了化学修饰的crRNA和tracrRNA。提供了具有5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于CRISPR基因组编辑的修饰的指导RNA
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年5月12日提交的美国临时申请序列号63/023,313的权益，所述申请的全部公开内容以引用方式并入本文。
[0003]关于联邦政府赞助研究或开发的声明
[0004]本专利技术是根据美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的授权号TR002668在政府支持下进行的。政府对本专利技术具有一定的权利。


[0005]本公开涉及用于CRISPR基因组编辑的修饰指导RNA的组合物和方法。

技术介绍

[0006]CRISPR RNA指导的基因组工程化变革了人类遗传疾病和生物学的许多其他方面的研究。许多基于CRISPR的体内或体外基因组编辑治疗正在接近临床试验。这场变革的核心是在II类CRISPR
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Cas系统中发现的微生物效应蛋白，诸如Cas9(II型)和Cas12a/Cpf1(V型)(Jinek等人Science 337,816
‑
821(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种化学修饰的指导RNA，其包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中所述crRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸；并且其中所述crRNA部分包含1至10个2
′‑
脱氧修饰的核糖基团。2.如权利要求1所述的化学修饰的指导RNA，其中所述修饰的核苷酸各自独立地包含核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。3.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2
′‑
O
‑
甲基、2
′‑
氟、2
′‑
脱氧、2
′‑
O
‑
(2
‑
甲氧基乙基)(MOE)、2
′‑
NH2(2
′‑
氨基)、4
′‑
硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2
′‑
(S)
‑
约束乙基(S
‑
cEt)、约束MOE和2
′‑
O，4
′‑
C
‑
氨基亚甲基桥联核酸(2
′
，4
′‑
BNA
NC
)组成的组。4.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中至少80％的所述核糖基团是化学修饰的。5.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中至少90％的所述核糖基团是化学修饰的。6.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中100％的所述核糖基团是化学修饰的。7.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。8.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2
‑
硫代尿苷、4
‑
硫代尿苷、N6‑
甲基腺苷、假尿苷、2，6
‑
二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5
‑
甲基胞嘧啶、5
‑
取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。9.如权利要求1所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含至少90％的修饰核苷酸。10.如权利要求1所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含100％的修饰核苷酸。11.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分的至少一个核苷酸包含2
′‑
脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。12.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置4、5、6、12、15、16、19、22、23和24处的一个或多个核苷酸包含2
′‑
脱氧化学修饰。13.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含2
′‑
脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。14.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置12处的核苷酸包含2
′‑
脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。15.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置15、16和19处的核苷酸包含2
′‑
脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每
一种。16.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置22、23和24处的核苷酸包含2
′‑
脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。17.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#mUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 38)；mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 40)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNdN#dN#fNfNdN#mNmGrU#rU#rU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU＃mG#mC#mU(crRNA 41)；mN#mN＃mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃rN#fNfNrN#mNmGdU#dU#dU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 42)；和mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNdN#fNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 44)，其中rN＝RNA，mN＝2
′‑
O
‑
甲基RNA，fN＝2
′‑
氟RNA，dN＝2
′‑
脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。18.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自表2的tracrRNA 2
‑
116中任一个的tracrRNA部分修饰模式。19.一种化学修饰的指导RNA，其包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含2
′‑
氟化学修饰或硫代磷酸酯化学修饰。20.如权利要求19所述的化学修饰的指导RNA，其包含一种或多种其他化学修饰，所述修饰选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。21.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2
′‑
O
‑
甲基、2
′‑
氟、2
′‑
脱氧、2
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O
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(2
‑
甲氧基乙基)(MOE)、2
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NH2(2
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氨基)、4
′‑
硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2
′‑
(S)
‑
约束乙基(S
‑
cEt)、约束MOE和2
′‑
O，4
′‑
C
‑
氨基亚甲基桥联核酸(2
′
，4
′‑
BNA
NC
)组成的组。22.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中至少80％的所述核糖基团是化学修饰的。23.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中至少90％的所述核糖基团是化学修饰的。24.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中100％的所述核糖基团是化学修饰的。25.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选
自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。26.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2
‑
硫代尿苷、4
‑
硫代尿苷、N6‑
甲基腺苷、假尿苷、2,6
‑
二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5
‑
甲基胞嘧啶、5
‑
取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。27.如权利要求19
‑
26中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含至少90％的修饰核苷酸。28.如权利要求19
‑
26中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含100％的修饰核苷酸。29.如权利要求19
‑
28中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含2
′‑
氟化学修饰。30.如权利要求29所述的化学修饰的指导RNA，其还包含从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置15、16、19、22、23和24中的一个或多个处的2
′‑
氟化学修饰。31.如权利要求29所述的化学修饰的指导RNA，其还包含从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置15、16、19、22、23和24处的2
′‑
氟化学修饰。32.如权利要求19
‑
28中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含硫代磷酸酯化学修饰。33.如权利要求32所述的化学修饰的指导RNA，其还包含从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置15、16、19、22、23和24中的一个或多个处的2
′‑
氟化学修饰。34.如权利要求32所述的化学修饰的指导RNA，其还包含从所述crRNA部分的5
′
端开始的位置15、16、19、22、23和24处的2
′‑
氟化学修饰。35.如权利要求19
‑
34中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：mN#mN#mN#rN#rN#rN＃mNmNmNmNrN#rN#rN#rN＃rN＃rN#rN＃rN#rN#mNmGrU＃rU＃rU#rU#rA#mGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 33)；mN#mN＃mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNrN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#N#mNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#rmU(crRNA 34)；mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNrN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#N#mNmGrUrUrUmUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 36)；mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU＃rU#mUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 37)；mN#mN#mN#rN#rN＃rN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 39)；和mN#mN#mN#fNfNfNmNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 45)，其中rN＝RNA，mN＝2
′‑
O
‑
甲基RNA，fN＝2
′‑
氟RNA，dN＝2
′‑
脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。36.如权利要求19
‑
35中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自表2的tracrRNA 2
‑
116中任一个的tracrRNA部分修饰模式。
37.一种化学修饰的指导RNA，其包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中所述crRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNmNrN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC＃mU(crRNA23)；mN#mN＃mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#fNfNfNrN#mNmGrU#rU#rU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU＃mG#mC＃mU(，crRNA24)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNfNmNmGrU#rU＃rU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA25)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃rN＃fNfNrN＃mNmGfUrU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA26)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#fUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA27)；mN#mN#mN＃mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mGG#mC#mU(crRNA28)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#fNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 29)；mN#mN#mN#NrNrNmNmNmNmNrNrNrNrNrNrNrNrNrNmNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mGG#mC#mU(crRNA 30)；mN#mN#mN#rNrNrNmNmNmNmNmNrNrNrNrNrrNrNrNmNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 31)；mN#mN#mN#rNrNrNmNmNmNmNmNrNmNmNrNrNrNrNrNmNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 32)；mN#mN#mN#NrNrNmNmNmNmNrNrNrNrNrNrNrNrNrNmNmGrUrUrUmUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 35)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNrN#fNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 43)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNmNrN#fNfNrN#mNmGrU#rUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG＃mC#mU(crRNA 46)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃mNfNfNrN＃mNmGrU#rUrU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA47)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃mNfNfNmNmNmGrU#rUrU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA48)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃rN#fNfNrN#mNmGmUrU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 49)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#mUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU (crRNA 50)：和
mG#mG#mU#mGmAmGmCmUmCmUfUfAfUfUrU#rG#fCfGrU#mAmGrU#rU#mUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG＃mC＃mU(crRNA 51)，其中rN＝RNA，mN＝2
′‑
O
‑
甲基RNA，fN＝2
′‑
氟RNA，dN＝2
′‑
脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。38.如权利要求37所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracr部分包含一个或多个修饰的核苷酸，其各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。39.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2
′‑
O
‑
甲基、2
′‑
氟、2
′‑
脱氧、
′‑
O
‑
(2
‑
甲氧基乙基)(MOE)、2
′‑
NH2(2
′‑
氨基)、4
′‑
硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2
′‑
(S)
‑
约束乙基(S
‑
cEt)、约束MOE和2
′‑
O，4
′‑
C
‑
氨基亚甲基桥联核酸(2
′
,4
′‑
BNA
NC
)组成的组。40.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中至少50％的所述核糖基团是化学修饰的。41.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中至少80％的所述核糖基团是化学修饰的。42.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中100％的所述核糖基团是化学修饰的。43.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。44.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2
‑
硫代尿苷、4
‑
硫代尿苷、N6‑
甲基腺苷、假尿苷、2,6
‑
二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5
‑
甲基胞嘧啶、5
‑
取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。45.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸。46.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含至少80％的修饰核苷酸。47.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含至少90％的修饰核苷酸。48.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含100％的化学修饰核苷酸。49.如权利要求37所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自表2的tracrRNA 2
‑
116中任一个的tracrRNA部分修饰模式。50.一种化学修饰的指导RNA，其包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中：所述crRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNNfNNfNNrN#rN#fNNfNNrN#mNmGrU#rU#rU#
fUfAmGmAmGmCmUmAmU＃mG#mC#mU(crRNA 20)；mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#fNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 29)；mN#mN#mN＃rN#rN#rN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 39)；mN#mN＃mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 40)；mN#mN#mN#fNfNfNmNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 45)；mN#mN＃mN＃dN＃dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfN#fN#fNfNfN#NmGfU#fU#fU#fU#fA#mGmAmGmC#mU#mA#mU#mG#mC#mU(crRNA81)；和mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfA＃mG＃mA#mG#mC#mU#mA#mU#mG#mC#mU(crRNA85)；并且所述tracrRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGfUfUmAfAmAmAfUmAmAmGmGfCfUmAfGfUfCmCfGfUfUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU＃mU#mU(tracrRNA 8)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGfUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 9)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmAfUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU＃mU#mU(tracrRNA 12)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUfCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 17)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCfGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 18)；mA＃mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArU＃mAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 37)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrC#rUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 38)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrU#rCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 41)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGfCfUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUm
CmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 49)；mA#mG＃mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArG#rU＃rC#mCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC＃mU＃mU#mU(tracrRNA 92)；mA#mG＃mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrC#rU#mArG#rU#rC#mCrGrUrUmAmUmCmamAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 95)；和mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUsUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCsUmArGsUrCmCrGsUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 107)，其中rN＝RNA，mN＝2
′‑
O
‑
甲基RNA，fN＝2
′‑
氟RNA，dN＝2
′‑
脱氧RNA，aN＝2
′‑
NH2(2
′‑
氨基RNA)，sN＝4
′‑
硫代RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。51.一种化学修饰的指导RNA，其包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中：所述crRNA部分和所述tracrRNA部分各自独立地包含至少一个化学修饰的核苷酸；并且所述tracrRNA部分包含至少一个2
′‑
脱氧修饰的核糖基团。52.如权利要求51所述的化学修饰的指导RNA，其中所述修饰的核苷酸各自独立地包含核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。53.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2
′‑
O
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甲基、2
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氟、2
′‑
脱氧、2
′‑
O
‑
(2
‑
甲氧基乙基)(MOE)、2
′‑
NH2(2
′‑
氨基)、4
′‑
硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2
′‑
(S)
‑
约束乙基(S
‑
cEt)、约束MOE和2
′‑
O，4
′‑
C
‑
氨基亚甲基桥联核酸(2
′
，4
′‑
BNA
NC
)组成的组。54.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中至少80％的所述核糖基团是化学修饰的。55.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中至少90％的所述核糖基团是化学修饰的。56.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中100％的所述核糖基团是化学修饰的。57.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。58.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2
‑
硫代尿苷、4
‑
硫代尿苷、N6‑
甲基腺苷、假尿苷、2，6
‑
二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5
‑
甲基胞嘧啶、5
‑
取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
59.如权利要求51所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含至少90％的修饰核苷酸。60.如权利要求51所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含100％的修饰核苷酸。61.如权利要求51
‑
60中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自由以下组成的组的tracrRNA部分修饰模式：mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGdUdUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 74)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmAdAmAmAdUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 75)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGdUdUmAdAmAmAdUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 76)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 77)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 78)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU＃mU#mU(tracrRNA 79)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmArGrUrCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 80)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmAdGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 81)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGdUdCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 82)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGrUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 83)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCdGrUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 84)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmAdGrUdCmCdGrUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmgmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 85)；mA#mG#mC＃mAmUmAmgmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGrUdCmCdGrUdUmAmUmCmAroamCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 86)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCrUmAdGrUdCmCdGrUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 87)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmAdUmAmAmGmGdCdUmArGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU＃mU(tracrRNA 104)；mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUdUmArAmAmAdUmAmAmGmGdCdUmAdGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC＃mU＃mU#mU(tracrRNA 105)；和mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGdUdUmAdAmAmAdUmAmAmGmGdCdUmAdGdUdCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 106)，其中rN＝RNA，mN＝2
′‑
O
‑
甲基RNA，fN＝2
′‑
氟RNA，dN＝2
′‑
脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。62.如权利要求51
‑
61中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自表1的crRNA 1
‑
134中任一个的crRNA部分修饰模式。63.一种化学修饰的指导RNA，其包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中所述tracrRNA部分包含选自表2的tracrRNA21
‑
116中任一个的修饰模式。64.如权利要求63所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含一个或多个修饰的核苷酸，其各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。65.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2
′‑
O
‑
甲基、2
′‑
氟、2
′‑
脱氧、2
′‑
O
‑
(2
‑
甲氧基乙基)(MOE)、2
′‑
NH2(2
′‑
氨基)、4
′‑
硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃里克，
申请(专利权)人：马萨诸塞大学，
类型：发明
国别省市：