转胰蛋白酶原基因在家蚕丝胶层表达制备自脱胶蚕丝中的应用制造技术

本发明专利技术公开了转胰蛋白酶原基因在家蚕丝胶层表达制备自脱胶蚕丝中的应用，通过将转胰蛋白酶原基因由丝胶层特异启动子控制胰蛋白酶原在家蚕丝胶层表达，获得转胰蛋白酶原整合的基因工程丝的自脱胶蚕丝，该蚕丝能够在温和的条件下有效地去除丝胶蛋白层，而且与热碱法丝素相比，自脱胶丝素具有更好的物理结构和机械性能，其他指标如平均当量直径、机械性能和平滑度等，都明显优于传统的热碱法获得的丝纤维，而且受到的损伤较小，从自脱胶蚕丝降解下来的丝胶多肽具有较强细胞增殖能力和良好的生物安全性，未来在纺织工业和医学领域具有广阔的应用前景。阔的应用前景。阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
转胰蛋白酶原基因在家蚕丝胶层表达制备自脱胶蚕丝中的应用


[0001]本专利技术涉及生物材料领域，具体涉及转胰蛋白酶原基因在家蚕丝胶层表达制备自脱胶蚕丝中的应用。

技术介绍

[0002]蚕丝作为一种天然的蛋白质长纤维，以其独特的美感、细度、舒适的触感、天然的光泽和坚韧的特性而受到人们的青睐，在世界服装行业中扮演着不可或缺的纤维原材料角色。目前，丝绸产业主要分布在全球20多个国家，主要包括中国、印度、乌兹别克斯坦、泰国、巴西等，并已深度融入当地经济和人们的日常生活中。然而，随着环境保护的压力增大，目前，大多数丝绸企业正在加速退出生丝市场，造成丝绸行业业绩急剧下滑，其根本原因在于现有的传统丝绸脱胶工艺会对环境造成了不良影响。目前，常用的丝胶脱胶方法是热碱法丝胶脱胶(AD
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S)，其采用的是沸腾的0.05～0.5％Na2CO3(w/v)溶液作为脱胶剂。这种方法可以简单、快速、廉价地完全去除位于丝线外层的丝胶蛋白，并在世界范围内得到广泛使用。但是这种传统的脱胶法极其耗水耗能。最近，根据全球生丝产量推算，丝绸行业的产量每年至少要消耗1.97
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108吨废水和3.28
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108千瓦时的电力；在中国这个丝绸的主要产区，每年要花费超过1亿美元来减少废水中的化物需氧量、化学需氧量和其他污染物以达到废水排放标准。更甚的是热碱法脱胶会破坏丝绸纤维的物理结构，降低其机械性能，不仅阻碍高速缫丝，而且影响丝织物的质量。
[0003]与传统的热碱法脱胶方法相比，酶法脱胶极具吸引力，因为在温和的环境下，它就可以完全快速地去除丝胶蛋白，还可以减少对丝绸结构完整性和机械性能的破坏，同时有效地减少水及能源消耗。因此，它是一种真正的绿色环保的丝胶脱胶技术。酶法脱胶是一个复杂的过程，其核心是通过蛋白水解酶加速蛋白质的降解。蛋白水解酶主要包括纤维素酶和果胶酶等酸性酶，木瓜蛋白酶和过氧化氢酶等中性酶，以及角蛋白酶和K蛋白酶等碱性酶，并已被广泛用于纺织工业过程中的棉花脱脂和羊毛漂白。对于蚕丝脱胶，以前的研究人员也尝试建立一种基于蛋白酶胶脱的新方法。比如从体外收集塔沙蚕的蚕茧酶和从木瓜中提取的商品木瓜蛋白酶去处理蚕丝。与热碱法脱胶的丝素相比，这些酶均能在温和的条件下有效地去除丝线的丝胶蛋白层，并且所获得的丝素更好地保持丝线纤维的天然颜色、光滑度、光泽、物理结构和抗张强度。然而，这些酶法脱胶技术到目前为止还没有大规模地应用于纺织工业。其主要原因是：1.蚕丝脱胶需要消耗大量的酶，但市场供应不足；2.商品酶的价格高于化学试剂，酶的消耗会增加生产成本；3.酶法脱胶系统的建立涉及到反应体系中的温度和pH值的调节，在能源和化学试剂的消耗上，与传统的脱胶方法相比，并不具有足够的竞争性优势。因此，能否在拥有强大蛋白质合成能力的丝腺中同时合成丝蛋白和外源蛋白酶，使他们混合均匀，最终生成新型的自脱胶蚕丝，是决定酶法脱胶技术能否大规模应用的关键因素。
[0004]因此，亟需开发一种自脱胶技术，通过转基因策略创造一种新颖的自脱胶蚕丝。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，为解决上述技术问题，本专利技术通过在中部丝腺特异表达外源性的猪胰蛋白酶原，使其均匀分布于蚕丝的丝胶层中，并在水中或者合适的缓冲液中自我激活为胰蛋白酶，从而可以有效地将降解丝胶层，为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]本专利技术的目的之一：
[0007]转胰蛋白酶原基因在家蚕丝胶层表达制备自脱胶蚕丝中的应用。
[0008]本专利技术优选的，所述转胰蛋白酶原基因为猪胰蛋白酶原基因。
[0009]本专利技术优选的，所述猪胰蛋白酶原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第25～720位所示。
[0010]本专利技术的目的之二：
[0011]基于转胰蛋白酶原基因制备自脱胶蚕丝的方法，其特征在于：将转胰蛋白酶原基因由丝胶层特异启动子控制胰蛋白酶原在家蚕丝胶层表达，筛选阳性转基因家蚕，阳性转基因家蚕的茧壳即为自脱胶蚕丝。
[0012]本专利技术优选的，所述转胰蛋白酶原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第25～720位所示。
[0013]本专利技术优选的，所述控制胰蛋白酶原在家蚕丝胶层表达的方法为：转胰蛋白酶原基因由丝胶1基因启动子Ser1和丝胶1基因Ser1PA的多腺苷酸化信号调控表达。
[0014]本专利技术优选的，所述阳性转基因家蚕获得方法如下：将含有转胰蛋白酶原基因的表达载体注射已解除滞育的家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，至成虫后进行自交或回交制种，筛选转基因阳性蛾圈。
[0015]本专利技术的目的之三：
[0016]所述方法制得的自脱胶蚕丝。蚕丝在丝胶层中含有猪胰蛋白酶原，其可以在水中和合适的缓冲液中激活为胰蛋白酶，从而可以有效地将丝胶层移去。
[0017]本专利技术中，所述蚕丝的丝胶层中含有转胰蛋白酶原。
[0018]本专利技术中WT表示野生型；TRYP表示胰蛋白酶原；TRY表示胰蛋白酶；SD
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S或Self
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D表示丝胶自脱胶；AD
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S或Akali
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D表示丝胶碱法脱胶；SD
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SSM表示丝胶自脱胶材料(即丝胶自脱胶蚕丝)；SD
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SSF表示丝胶自脱胶的丝素；AD
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SSF表示碱法脱胶的丝素。
[0019]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种丝胶自脱胶蚕丝，利用丝腺中基于Ser
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1的家蚕外源基因特异性表达技术，开发了一种与猪胰蛋白酶原(TRYP)蛋白整合的基因工程丝的自脱胶蚕丝，在加速反应体系(1mM Tris
‑
HCl，pH＝8.0，37℃)中，基因工程蚕丝的丝胶脱胶率在24h内达到29.28
±
0.07％，虽然比传统热碱法的35.03
±
0.07％略低，但是已经满足缫丝要求。研究结果表明，与热碱法脱胶相比，自脱胶蚕丝不仅可以在温和的条件下有效地去除丝胶蛋白层，而且与热碱法丝素相比，自脱胶丝素具有更好的物理结构和机械性能，其他指标如平均当量直径、机械性能和平滑度等，都明显优于传统的方法获得的丝纤维，而且受到的损伤较小，从自脱胶蚕丝降解下来的丝胶多肽具有较强细胞增殖能力和良好的生物安全性，未来在纺织工业和医学领域具有广阔的应用前景。
附图说明
[0020]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行
说明：
[0021]图1为转基因TRYP家蚕的建立和鉴定(A：pBac
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TRYP转基因载体的简图；B：转基因蚕的胚胎(a,b)、蛹(c,d)和蚕蛾(e,f)的荧光图像，(比例尺，200μm)；C：猪TRYP的氨基酸序列，在N端有一个6
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his标签(红色)，用于检测自我激活过程。FPTDDDDK(绿色)已被报道为TRYP的抑制肽；D：SDS
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PAGE和Weste本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.转胰蛋白酶原基因在家蚕丝胶层表达制备自脱胶蚕丝中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述转胰蛋白酶原基因为猪胰蛋白酶原基因。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述猪胰蛋白酶原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第25～720位所示。4.基于转胰蛋白酶原基因制备自脱胶蚕丝的方法，其特征在于：将转胰蛋白酶原基因由丝胶层特异启动子控制胰蛋白酶原在家蚕丝胶层表达，筛选阳性转基因家蚕，阳性转基因家蚕的茧壳即为自脱胶蚕丝。5.根据权利要求4所述基于转胰蛋白酶原基因制备自脱胶蚕丝的方法，其特征在于：所述转胰蛋白酶原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第25～720位所示。6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏庆友，王日远，王元成，田弛，宋建欣，赵萍，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：