一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法技术

本发明专利技术公开了一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法。该方法在MEP通路中构建了FPP合成通路，使MEP通路导向合成FPP，并异源表达广藿香醇合成酶，然后以FPP为底物合成广藿香醇。本发明专利技术以番茄果实为底盘，在其细胞质体的MEP通路中重构广藿香醇合成通路，并构建了融合基因，然后利用果实特异性启动子PG(聚半乳糖醛酸酶)驱动融合基因SPPTS和DXS

【技术实现步骤摘要】
一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法。

技术介绍

[0002]广藿香(Pogostemonis Herba)，属于唇形科的药用植物，主要应用价值是广藿香精油。广藿香精油具有杀虫、抗病原菌、抗真菌等作用，常用于制造肥皂、香水、沐浴露和清洁剂等。广藿香精油含有大量的次级代谢产物包括广藿香醇和广藿香酮，是其香气的主要来源。广藿香醇是一种天然的三环倍半萜，在我国是作为广藿香药材和广藿香精油质量评价的标志化合物。广藿香醇具有多种有益的药理特性，如免疫增强活性、抗炎活性、抗癌活性、抗氧化活性、抗病原微生物、抗菌活性、抗病毒活性、抗真菌活性、杀虫活性和镇静安神活性。广藿香醇的合成通路已被解析，通过细胞质的MVA通路合成，法尼基焦磷酸(FPP)是倍半萜类化合物(C15)的前体物质，由一分子DMAPP和两分子IPP通过法尼基焦磷酸酯合成酶(FPPS)缩合而成。倍半萜类化合物由倍半萜合成酶催化FPP生成。FPP在广藿香醇合成酶(PcPS；PTS,uniprot:Q49SP3)的催化下转化为广藿香醇。
[0003]目前广藿香醇的主要来源是从广藿香植物中提取，但提取过程复杂，成本高昂。尽管近年来以代谢工程为背景，在酿酒酵母、青苔门菌和青微藻衣原体等多个微生物宿主表达广藿香醇合成酶来合成广藿香醇，但存在一些问题，例如需要外加大量碳源和能源并难以大规模推广。因此发掘潜在的经济、环保、高效的代谢工程宿主底盘是解决以上问题的关键。
专利
技术实现思路

[0004]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法，以番茄果实为底盘，在细胞质体中重组广藿香醇合成通路，构建融合基因，将代谢流从类胡萝卜素(主要为番茄红素)的生物合成导向广藿香醇的生物合成，建立了高量合成广藿香醇的方法，可有效的提升广藿香醇的合成。
[0005]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006]一种提升广藿香醇合成量的方法，在MEP通路中构建FPP合成通路，使MEP通路导向合成法尼尔基焦磷酸，并异源表达广藿香醇合成酶，然后以FPP为底物合成广藿香醇。
[0007]进一步地，以番茄果实为植物底盘，并在果实细胞质体的MEP通路中构建FPP合成通路。
[0008]进一步地，MEP通路中构建FPP合成通路的过程为：
[0009]将FPPS与果实质体MEP通路中的定位基因DXS融合，构建如SEQ ID NO.7所示的DXS
‑
FPPS基因，通过该基因使FPP在果实质体中定位合成；FPPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]进一步地，DXS基因去除终止密码子后，以SSSG作为连接肽与FPPS连接。
[0011]在MEP通路中合成FPP的过程还包括：
[0012]在FPPS的氨基端(N
‑
端)连接水芹烯合酶PHS1的信号肽SP，在果实质体内构建如SEQ ID NO.5所示的SPFPPS融合基因，使其在细胞质体中超表达FPPS。
[0013]进一步地，广藿香醇合成酶PTS氨基端(N
‑
端)连接有信号肽SP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的SPPTS。
[0014]进一步地，启动子为PG(聚半乳糖醛酸酶)启动子。
[0015]一种以番茄果实为植物底盘提升广藿香醇合成量的方法，包括以下步骤：
[0016](1)分别获得含有如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的番茄转基因植株；
[0017](2)将含有SEQ ID NO.7所示序列的番茄转基因植株分别与含有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示序列的番茄转基因植株杂交，种植T0代种子，然后筛选获得阳性植株即可。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]1、本专利技术以番茄果实为底盘，在其细胞质体的MEP通路中重构广藿香醇合成通路，并构建了融合基因DXS
‑
FPPS，然后利用果实特异性启动子PG(聚半乳糖醛酸酶)，驱动融合基因SPPTS和DXS
‑
FPPS的超表达，将MEP通路中的代谢流从类胡萝卜素(主要为番茄红素)的生物合成导向合成广藿香醇，可显著提升广藿香醇的合成量，使其鲜重合成量可达84.7μg/g，是目前已报道的以高等植物为底盘合成倍半萜化合物广藿香醇的最高产量。
[0020]2、本专利技术选择番茄果实作为底盘，在果实成熟的启动子控制下，通过本申请在MEP通路中重构的广藿香醇合成通路，可将代谢流从类胡萝卜素的生物合成导向广藿香醇的生物合成，且不会对植物正常的营养生长及光合作用产生影响。此外，番茄果实的收割体系及相关化合物的提取工艺都比较成熟。因此，番茄果实是一种经济、环保、高效的合成植物萜类及其衍生物的植物底盘。
附图说明
[0021]图1为FPPS、PTS、SPFPPS、SPPTS和DXS
‑
FPPS基因的亚细胞定位；
[0022]图2为PTS、FPPS和DXS基因在不同转基因番茄中的表达量；
[0023]图3为GC
‑
MS检测AC和SPPTS转基因番茄果实中倍半萜化合物的色谱图；
[0024]图4为RT
‑
PCR分析FPPS、PTS和DXS在不同转基因植物和野生型番茄果实中的表达量；
[0025]图5为AC和不同转基因番茄成熟果实的照片及番茄红素的含量；
[0026]图6为GC
‑
MS分析不同转基因番茄果实中FPP的含量；
[0027]图7为GC
‑
MS分析不同转基因植物和野生型番茄成熟果实中倍半萜的色谱图及广藿香醇含量。
具体实施方式
[0028]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易
见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。
[0029]本专利技术所用的原生质体亚细胞定位载体是pTF486，GFP蛋白位于碳端(C
‑
端)实验室保存。pBIN19
‑
PG是文献报道的果实成熟特异性表达载体，本实验室保存，使用的野生型番茄品种为“Solanum lycopersicon Mill.cv.Ailsa Craig”，是实验室保留品种。
[0030]实施例1融合基因的亚细胞定位
[0031]一、拟南芥原生质体亚细胞定位载体构建
[0032]需要构建的载体包括：PTF
‑
SP、PTF
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DXS、PTF
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FPPS、PTF
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提升广藿香醇合成量的方法，其特征在于，在MEP通路中构建FPP合成通路，使MEP通路导向合成FPP，并异源表达广藿香醇合成酶，然后以FPP为底物合成广藿香醇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以番茄果实为植物底盘，在果实细胞质体的MEP通路中构建FPP合成通路。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MEP通路中构建FPP合成通路的过程为：将FPPS与MEP通路中的关键基因DXS融合，构建如SEQ ID NO.7所示的DXS
‑
FPPS基因，通过该融合基因使FPP在果实质体中定位合成；所述FPPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DXS基因去除终止密码子后，以SSSG作为连接肽与FPPS连接。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在MEP通路中合成FPP的过程还包括：在FPPS的氨基端连接水芹烯合酶PHS1的质体定位信号肽SP，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐海洋，陈静，王莹，谭静，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：