一种羧基微球偶联氨基的方法技术

本发明专利技术公开了一种羧基微球偶联氨基的方法，其中，所述羧基偶联氨基时，使用4

【技术实现步骤摘要】
一种羧基微球偶联氨基的方法


[0001]本专利技术涉及一种羧基微球偶联氨基的方法，属于体外诊断试剂盒领域。

技术介绍

[0002]体外诊断，即IVD(In Vitro Diagnosis)，是指在人体之外，通过对人体样本(血液、体液、组织等)进行检测而获取临床诊断信息，进而判断疾病或机体功能的产品和服务。体外诊断行业与检验医学构成了既相互区别又相互紧密联系的有机整体。体外诊断行业是检验医学的“工具”和“兵器”，同时检验医学是体外诊断行业的“用户”和“市场”，两者的共同目的是实施体外诊断。临床诊断信息的80％左右来自体外诊断，而其费用占医疗费用不到20％。体外诊断已经成为人类疾病预防、诊断、治疗日益重要的组成部分。
[0003]体外诊断目前主要的方法有酶联免疫法、胶乳比浊法、化学发光法、流式荧光法及分子诊断等方法。胶乳比浊法、化学发光法、流式荧光法中涉及用到微球标记蛋白。微球标记蛋白(抗原或抗体或亲和素)的方法主要是吸附法和共价偶联法，目的是将待测物质相对应的抗体或抗原包被在微球上，通过待测物质与包被了相应抗原抗体的微球反应后的特性进行检测提高试验的敏感性。共价偶联法中常用的微球表面偶联有功能基团
‑‑
羧基。目前羧基微球偶联氨基的通用方法有两种：一是以碳二亚胺(EDC)为交联剂的一步法，二是以碳二亚胺(EDC)与N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)为交联剂的两步法。
[0004]一步法的原理是：EDC首先与羧基反应形成中间产物，中间产物与氨基反应，然后脱去中间产物，实现羧基与氨基的偶联。该方法的缺点是EDC试剂对水敏感，要求现用现配，且中间产物在水溶液中极不稳定，易水解，导致偶联效率偏低，整个反应不可控，终产物除了目的产物外，可能还会有大量的多个蛋白自连产物，这样不仅浪费蛋白，还大大降低了反应效率。
[0005]两步法的原理是：EDC首先与羧基反应，然后与NHS反应形成中间产物，中间产物与氨基反应，然后脱去中间产物，实现羧基与氨基的偶联。两步法的中间产物相对于一步法的中间产物在水溶液中的稳定性略强，但随着反应的进行，形成的副产物会抑制羧基在偶联蛋白上的定位，导致偶联效率降低。同时EDC对pH值敏感，活化羧基的最适pH值在3.5
‑
4.5，但是活化羧基后形成的中间产物与氨基偶联的最适pH在4.5
‑
7.5，在实际应用过程中，这种操作比较繁琐，影响反应效率。另外EDC可与磷酸基团发生反应，所以在EDC参与的反应过程中不能使用磷酸缓冲液，但是磷酸缓冲液是在本领域内常用的、易配制且价廉的缓冲液。因此，现有技术中的一步法和二步法均由于使用EDC作为交联剂，导致反应条件受到诸多限制，操作条件的苛刻与操作步骤的繁琐进一步导致了目前的羧基微球偶联氨基方法成本高、偶联效率低。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是获得一种新的、成本低、操作简便的羧基微球偶联氨基的方法。
[0007]为实现上述专利技术目的之一，本专利技术采用的羧基微球偶联氨基的方法的技术方案如下：
[0008]本专利技术使用4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉四氟硼酸盐或4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉六氟磷酸盐作为交联剂。
[0009]4‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉四氟硼酸盐或4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉六氟磷酸盐是一种在溶液或者固相肽合成中活化羧酸的试剂，但至今未见其应用于羧基微球标记蛋白领域。
[0010]优选的，所述偶联方法包括如下步骤：
[0011]a)将羧基微球与待偶联的蛋白按照质量比1：0.01
‑
50混匀于偶联缓冲液中；所述羧基微球与偶联缓冲液的质量体积比(w/v)为0.1％
‑
1％；按照与微球所含羧基的摩尔比1:1
‑
10加入4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉四氟硼酸盐或4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉六氟磷酸盐，振荡混匀；
[0012]b)将步骤a)中混匀的混合物离心后弃上清，加入含BSA 0.1％
‑
10％的Tris封闭缓冲溶液重悬浮，再离心，弃上清；前述步骤重复1
‑
2次；
[0013]c)加入BSA 0.1％
‑
10％的Tris封闭缓冲液重悬浮，振荡，离心，弃上清，再加入含BSA0.1％
‑
10％的缓冲溶液重悬浮。
[0014]优选的，所述偶联缓冲液包括2
‑
吗啉代乙磺酸、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、3
‑
(N
‑
吗啉基)丙磺酸或N
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
N'
‑2‑
乙烷磺酸，浓度为10
‑
200mM，pH值为4.5
‑
9.0。
[0015]进一步的，所述Tris缓冲液的pH值为6.5
‑
9.0。
[0016]更优选的，所述步骤a)中，羧基微球与待偶联的蛋白按照质量比为1：0.02
‑
10，所述羧基微球与偶联缓冲液的质量体积比(w/v)为0.2％
‑
0.5％；按照与微球所含羧基的摩尔比1：1
‑
5加入4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉四氟硼酸盐或4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉六氟磷酸盐。
[0017]更优选的，所述步骤a)中，羧基微球与待偶联的蛋白按照质量比为1：0.05；按照与微球所含羧基的摩尔比1：1加入4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉四氟硼酸盐或4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉六氟磷酸盐。
[0018]作为一种优选的实施方式，步骤a)和步骤c)所述的振荡，其时间为1
‑
24小时。
[0019]作为一种优选的实施方式，步骤a)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，所述羧基偶联氨基时，使用4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉四氟硼酸盐或4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉六氟磷酸盐作为交联剂。2.根据权利要求1所述的羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，偶联方法包括如下步骤：a)将羧基微球与待偶联的蛋白按照质量比1：0.01
‑
50混匀于偶联缓冲液中；所述羧基微球与偶联缓冲液的质量体积比(w/v)为0.1％
‑
1％；按照与微球所含羧基的摩尔比1:1
‑
10加入4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉四氟硼酸盐或4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉六氟磷酸盐，振荡混匀；b)将步骤a)中混匀的混合物离心后弃上清，加入含BSA0.1％
‑
10％的Tris封闭缓冲溶液重悬浮，再离心，弃上清；前述步骤重复1
‑
2次；c)加入BSA0.1％
‑
10％的Tris封闭缓冲液重悬浮，振荡，离心，弃上清，再加入含BSA 0.1％
‑
10％的缓冲溶液重悬浮。3.根据权利要求2所述的羧基微球偶联氨基的方法，其特征在于，所述偶联缓冲液包括2
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吗啉代乙磺酸、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、3
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(N
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吗啉基)丙磺酸或N
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(2
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羟乙基)哌嗪
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N'
‑2‑
乙烷磺酸，浓度为10
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20...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶婷，阮荣，苏正稳，
申请(专利权)人：武汉安智因医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：