具有级联反应功能的DNA水凝胶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种具有级联反应功能的DNA水凝胶及其制备方法和应用，载体为纯DNA体系，通过滚环复制的方式形成，在滚环复制过程中产生具有靶向功能的AS1411核酸适体序列和缺氧诱导因子HIF

【技术实现步骤摘要】
具有级联反应功能的DNA水凝胶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物化学纳米材料
，具体涉及一种具有级联反应功能的DNA水凝胶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]实体肿瘤具有严重缺氧、过氧化氢(H2O2)含量升高和过表达谷胱甘肽(GSH)的特征。特殊的肿瘤微环境促进了癌症的扩散和转移，这使得难以通过单一疗法完全治愈癌症。研究发现许多用于治疗癌症的纳米颗粒具有良好的治疗效果，且毒副作用较低，如DNA纳米颗粒、硅纳米颗粒等。尽管已经进行了大量的实验研究，以纳米材料为基础的肿瘤诊疗方法仍面临着巨大的挑战。
[0003]由于其精准的沃森
‑
克里克配对及简单的合成过程，DNA已经被应用于许多研究领域，其中DNA纳米技术是一项重要的应用。G
‑
四链体(G
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quadruplex)是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构，当G
‑
四链体与血红素形成复合物(G4/H)后，将具有过氧化氢酶活性，催化H2O2介导的反应。
[0004]饥饿治疗是一种新兴的治疗方法，通过阻止营养供应，以抑制肿瘤生长。由于阻断肿瘤细胞的营养物质和能量的供给，仅仅会延迟肿瘤恶化的过程，仍然难以达到理想的治疗效果。因此，发展与饥饿治疗相结合的协同疗法在癌症的治疗中具有深远意义。光动力疗法(PDT)由于其高选择性、低副作用和良好的适应性而迅速发展。然而，缺氧诱导因子
‑
1α(HIF
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1α)作为介导细胞缺氧反应的最重要的转录因子之一,可通过促进肿瘤血管的形成、提高细胞的糖酵解水平等作用，使肿瘤适应缺氧环境。大量实验结果表明，肿瘤在缺氧的微环境中，PDT治疗效果明显降低。
[0005]针对以上现有问题以及DNA水凝胶的优点，目前亟需研究一种新兴的治疗恶性肿瘤的DNA纳米水凝胶及其制备方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题为：克服单一治疗方式的缺陷，提供一种由DNA分子自组装形成的具有高效，毒副性较低，生物相容性较好等优点的高效治疗恶性肿瘤的水凝胶的制备。
[0007]本专利技术的技术方案为：
[0008]具有级联反应功能的DNA水凝胶的制备方法，首先设计直链DNA复制模板，通过滚环复制的方式形成纯DNA体系的水凝胶，直链DNA中设计了AS1411核酸适体互补序列和缺氧诱导因子HIF
‑
1α的反义DNA的互补序列，在复制过程中产生大量HIF
‑
1α的反义DNA和AS1411核酸适体序列，然后将胆固醇修饰的核酸适体AS1411序列，通过Waston
‑
Crick碱基互补配对原则杂交，离心后自组装形成DNA水凝胶纳米结构。
[0009]进一步地，所述直链DNA复制模板的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，且5
’
端磷酸化。
[0010]进一步地，所述的核酸适体为FAM
‑
AS1411
‑
Chol，其为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列且5
’
端修饰有FAM基团、3
’
端修饰有胆固醇。
[0011]优选的，具体步骤如下：
[0012](1)取SEQ ID No.1所示且5
’
端磷酸化的直链DNA模板与引物以相同浓度进行退火处理；
[0013](2)加入T4连接酶及T4连接酶缓冲液，室温维持6h，形成DNA转录模板；
[0014](3)加入phi29 DNA聚合酶，dNTP，phi29 DNA聚合酶缓冲液以及BSA在30℃下维持8h，形成高聚物DNA水凝胶载体；
[0015](4)将步骤(3)得到的DNA水凝胶载体与及靶向肿瘤细胞的AS1411核酸适体在含有K
+
的缓冲溶液内95℃下维持5min，缓慢降至25℃，在4℃冰箱中放置2h，8000rpm离心，形成最终DNA水凝胶载体。
[0016](5)将步骤(4)得到的DNA水凝胶血红素和二氢卟吩e6混合，在25℃下维持2h，缓慢降至25℃，通过10kDa的超滤管，8000rpm离心5min洗涤3次后，将溶剂替换为灭菌水，形成负载Ce6、Hemin的DNA水凝胶；
[0017](6)将步骤(4)得到的DNA水凝胶与血红素和二氢卟吩e6混合，在25℃下维持2h，缓慢降至25℃，通过10kDa的超滤管，8000rpm离心5min洗涤3次后，将溶剂替换为灭菌水，形成负载Ce6、Hemin的DNA水凝胶；
[0018](7)将葡萄糖氧化酶溶解在5mM碳酸氢盐缓冲液(pH 8.3)中至1mg/mL，将200mg/mL丙烯酰胺(AAm)添加到1mL葡萄糖氧化酶溶液中，在4℃下搅拌10min，搅拌下加入N
‑
(3
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氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APMAAm)、二甲基丙烯酸甘油酯(GDA)、30μL过硫酸铵和3μL的N，N，N'，N'
‑
四甲基乙二胺，继续反应4h，然后在超速离心装置(MWCO 30kDa，Millipore)中用磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)更换缓冲液以除去过量的单体和引发剂。即得到用正电荷聚电解质包裹的葡萄糖氧化酶纳米颗粒N(GOx)。
[0019](8)将步骤(6)得到的DNA水凝胶与步骤(7)得到的N(GOx)按一定比例混合，25℃摇床30min混合，用100kDa的超滤管超滤，形成最终的具有级联反应功能的DNA水凝胶。
[0020]进一步地，所述退火处理的方法为：在含有K
+
的缓冲液中加热至95℃维持5min，随即1℃/min冷却至25℃，使AS1411核酸适体形成G四链体。
[0021]进一步地，所述N(GOx)制备所用试剂比例为：AAm/APMAAm/GDA的摩尔比为10/1/0.15。
[0022]本专利技术中，所述的血红素与AS1411形成的G四链体结合(AH)具有过氧化物酶催化活性，能催化肿瘤内源过氧化氢生成氧气。
[0023]所述的GOx消耗氧气与葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。
[0024]述Ce6将氧气转化为具有细胞毒性的单线态氧，实现恶性肿瘤的光动力治疗。
[0025]所述的HIF
‑
1α反义DNA的互补序列可通过与HIF
‑
1α反义DNA序列互补配对，从而下调HIF
‑
1α，进一步促进肿瘤的光动力治疗。
[0026]本专利技术的具有级联反应功能的DNA水凝胶在恶性肿瘤靶向治疗药物上的应用。
[0027]核酸适体，是使用的苏州大学刘庄课题组通过筛选选出来的适体。与肿瘤细胞表面核仁素特异性结合，从而实现靶向给药。在后续实验工作中作为对照组而构建的DNA基因纳米探针，也具有一定的靶向治疗作用。
[0028]胆固醇(Chol)，具有疏水性，可以促进DNA的转录副本形成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有级联反应功能的DNA水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先设计直链DNA复制模板，通过滚环复制的方式形成纯DNA体系的水凝胶，直链DNA中设计AS1411核酸适体互补序列和缺氧诱导因子HIF
‑
1α的反义DNA的互补序列，在复制过程中产生大量HIF
‑
1α的反义DNA和AS1411核酸适体序列；然后将胆固醇修饰的核酸适体AS1411序列，通过Waston
‑
Crick碱基互补配对原则杂交，离心后自组装形成DNA水凝胶纳米结构。2.根据权利要求1所述的具有级联反应功能的DNA水凝胶的制备方法，其特征在于：所述直链DNA复制模板的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，且5
’
端磷酸化。3.根据权利要求1所述的具有级联反应功能的DNA水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的AS1411核酸适体为FAM
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AS1411
‑
Chol，其为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列且5
’
端修饰有FAM基团、3
’
端修饰有胆固醇。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的具有级联反应功能的DNA水凝胶的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)取SEQ ID No.1所示且5
’
端磷酸化的直链DNA模板与引物以相同浓度进行退火处理；(2)加入T4连接酶及T4连接酶缓冲液，室温维持6h，形成DNA转录模板；(3)加入phi29 DNA聚合酶，dNTP，phi29 DNA聚合酶缓冲液以及BSA在30℃下维持8h，形成高聚物DNA水凝胶载体；(4)将步骤(3)得到的DNA水凝胶载体与及靶向肿瘤细胞的AS1411核酸适体在含有K
+
的缓冲溶液内95℃下维持5min，缓慢降至25℃，在4℃冰箱中放置2h，8000rpm离心，形成最终DNA水凝胶载体；(5)将步骤(4)得到的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雪梅，刘霄凡，刘仁村，张书圣，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：