一种基于特异性核酸适配体的抗dsDNA抗体电化学检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于特异性核酸适配体的抗dsDNA抗体电化学检测方法。本发明专利技术采用分子对接和分子模拟等方法设计能与抗dsDNA抗体Fab片段异性结合的DNA适配体，并使用微量热电泳仪（MST）进行亲和活性验证。采用polyAn作为防污涂层用于阻断金电极表面的剩余活性位点，将DNA适配体固定在电极上作为亲和捕获配体。同时，制备二抗标记的金纳米颗粒作为信号放大标签，用于生物传感器电荷转移电阻的净增加。成功构建基于电化学阻抗谱（EIS）分析平台的金电极GE/DNA/polyAn生物传感器，用于快速准确地检测血清中的抗dsDNA抗体。地检测血清中的抗dsDNA抗体。

【技术实现步骤摘要】
一种基于特异性核酸适配体的抗dsDNA抗体电化学检测方法


[0001]本专利技术涉及电化学生物传感器，具体地涉及一种GE/DNA/polyA
n
生物传感器及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种全身多系统损害的自身免疫病，临床表现为免疫炎症的弥漫性结缔组织病，以血清中出现多种自身抗体和免疫复合物为特点。抗双链DNA抗体(Anti
‑
dsDNA antibody，抗dsDNA抗体)是SLE的特异性抗体，对SLE的特异性可达85％以上，被纳入美国风湿病学会SLE诊断标准。由于该抗体滴度的升降与病情活动密切相关，故被列为SLE疾病活动指标之一。
[0003]建立抗dsDNA抗体的精准检测方法，对SLE的诊断及疾病活动度判断具有非常重要的临床意义。目前检测抗dsDNA抗体的方法主要有放射免疫法(radioimmunoassay,RIA法)、间接免疫荧光法indirect immunofluorescence,IIF)、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等。因存在放射性核素的污染，RIA法已极少用于抗dsDNA抗体的检测。IIF法特异性较高，但其检测结果需要用荧光显微镜观察，且影响因素较多，对检验人员技术和经验要求较高，无法用于SLE疾病活动度的监测。ELISA敏感性高、操作简便、可以半定量或定量检测抗dsDNA抗体，但方法特异度不高，容易造成假阳性结果。现在普遍建议联合检测抗双链DNA抗体，以高通量的ELISA作为抗dsDNA抗体的初筛实验，减少对稳定期SLE的漏诊率；用特异度较高的IIF复查，减少假阳性和假阴性的发生。当这两种方法出现不一致时就会产生疑惑，有研究数据显示，不一致中以IIF阴性ELISA阳性居多。而这种不一致更多的指向抗体的亲和力。因此临床上迫切需要操作简便、准确度高的抗dsDNA抗体的检测方法，以提高SLE的诊疗水平。
[0004]电化学分析以其检测快速、成本低、操作简便等优点而著称，已广泛应用于临床、环境和工业领域。其中，电化学阻抗谱(EIS)是一种直接测量目标分析物引起的电极表面变化的技术，通过一种简单和无标记的策略，可检测基质复杂的生物标志物。例如，基于抗原或抗独特型抗体的EIS生物传感器近年来被广泛应用于特异抗体和其他蛋白的快速检测。然而，由于电极表面不可忽视的非特异性结合，这些基于EIS分析策略的应用在很大程度上受到限制。例如，血清中大量干扰蛋白会严重增加本底反应，降低生物传感器的检测灵敏度。此外，已报道的这些基于免疫的EIS生物传感器高度依赖于重组抗原或抗独特型抗体作为捕获配体，价格昂贵，稳定性欠佳且由于批次间的差异，通常重现性较差。因此，开发高效的防污涂层材料，联合表位模拟肽这种高特异性、廉价、稳定的捕获配体，是成功开发新型基于EIS的抗体检测平台的重要途径。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的上述缺陷，本专利技术提供了一种快速准确地检测血清中的抗dsDNA抗体的GE/DNA/polyA
n
生物传感器及检测方法。本专利技术采用分子对接和分子模拟等方法设
计能与抗dsDNA抗体Fab片段异性结合的DNA适配体，固定在电极上作为亲和捕获配体；采用polyA
n
作为防污涂层用于阻断金电极表面的剩余活性位点；制备二抗标记的金纳米颗粒作为信号放大标签，用于生物传感器电荷转移电阻的净增加。
[0006]本专利技术的技术方案是通过以下技术方案来实现的：
[0007]本专利技术提供一种抗dsDNA抗体的DNA适配体，其含有如下序列的双链DNA探针：
[0008]链1：5
’‑
GATCGTAGCTGTCCCGTCCATAATCACTCG
‑3’
(SEQ ID NO.1)
[0009]链2：3
‘‑
CTAGCATCGACAGGGCAGGTATTAGTGAGCG
‑5’
(SEQ ID NO.2)。
[0010]进一步第，本专利技术所述DNA适配体按照下述方式配对：
[0011][0012]上述DNA链的5
’
端进行
‑
SH修饰。
[0013]本专利技术得另一技术目的是提供一种GE/DNA/polyA
n
生物传感器，其含有如权利要求1所述的DNA适配体。
[0014]进一步地，本专利技术所述polyA
n
溶液作为防污涂层用于阻断金电极表面剩余活性位点；将DNA适配体固定在电极上作为亲和捕获配体；将二抗标记的金纳米颗粒作为信号放大标签，用于生物传感器电荷转移电阻的净增加。
[0015]进一步地，本专利技术所述polyA
n
溶液通过以下方法制备：将碱基数n为20～50的polyA
n
粉末离心溶解在pH 7.5
±
0.1的PBS中，配置成浓度为50μM的溶液。
[0016]进一步地，本专利技术所述所述金纳米颗粒通过以下方法制备：将200mL的0.01％四氯金酸溶解于5
±
1mL的1.0％柠檬酸三钠水溶液，搅匀，溶液由灰色变为酒红色，脱离热源静置即生成胶体纳米金，冷却至室温，直至形成透明的红色均相金纳米胶体溶液。
[0017]进一步地，本专利技术所述二抗标记的金纳米颗的制备方法如下：将40～60μL稀释后的Fc区二抗与400～500μL金纳米颗粒溶液混合后孵育后离心，冲洗，取沉淀物溶解于PBS中备用；优选地，所述Fc区二抗的稀释是以Fc区二抗与PBS按体积比1：8～9。
[0018]本专利技术得另一技术目的是提高一种GE/DNA/polyA
n
生物传感器的制备方法，包括以下具体步骤：
[0019]1)GE/polyA
n
和GE/BSA电极的制备：将polyA
n
溶液和BSA缓冲液分别滴于抛光的金电极表面，孵育，冲洗净，得GE/polyA
n
和GE/BSA电极，保存在PBS中备用；
[0020]2)DNA适配体修饰金电极的制备：将预处理后的金电极浸泡在400～600μM的DNA适配体溶液中，孵育洗涤后浸泡polyA
n
溶液中，洗涤后放入PBS缓冲液中保存；
[0021]3)信号放大标签的制备：将40～60μL稀释后的Fc区二抗与400～500μL金纳米颗粒溶液混合后孵育后离心，冲洗，取沉淀物溶解于PBS中备用；优选地，所述Fc区二抗的稀释是以Fc区二抗与PBS按体积比1：8～9；
[0022]进一步地，本专利技术所述金电极预处理包括以下步骤：将金电极抛光打磨，超声清洗，强碱清洗，强酸清洗，用31％H2O2与浓H2SO4按照体积比1:3配置食人鱼溶液清洗，超声清
洗；优选地，所述强碱为0.1M NaOH；优选地本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗dsDNA抗体的DNA适配体，其特征在于，所述DNA适配体为含有如下序列的双链DNA探针：链1：5
’‑
GATCGTAGCTGTCCCGTCCATAATCACTCG
‑3’
(SEQ ID NO.1)链2：3
‘‑
CTAGCATCGACAGGGCAGGTATTAGTGAGCG
‑5’
(SEQ ID NO.2)。2.根据权利要求1所述的抗dsDNA抗体的DNA适配体，其特征在于，所述DNA适配体按照下述方式配对：上述DNA链的5
’
端进行
‑
SH修饰。3.一种GE/DNA/polyA
n
生物传感器，其特征在于，所述生物传感器含有如权利要求1所述的DNA适配体。4.如权利要求3所述的GE/DNA/polyAn生物传感器，其特征在于，polyA
n
溶液作为防污涂层用于阻断金电极表面剩余活性位点；将DNA适配体固定在电极上作为亲和捕获配体；将二抗标记的金纳米颗粒作为信号放大标签，用于生物传感器电荷转移电阻的净增加。5.如权利要求4所述的GE/DNA/polyAn生物传感器，其特征在于，polyA
n
溶液通过以下方法制备：将碱基数n为20～50的polyA
n
粉末离心溶解在pH 7.5
±
0.1的PBS中，配置成浓度为50μM的溶液。6.如权利要求4所述的GE/DNA/polyAn生物传感器，其特征在于，所述金纳米颗粒通过以下方法制备：将200mL的0.01％四氯金酸溶解于5
±
1mL的1.0％柠檬酸三钠水溶液，搅匀，溶液由灰色变为酒红色，脱离热源静置即生成胶体纳米金，冷却至室温，直至形成透明的红色均相金纳米胶体溶液。7.如权利要求4所述的GE/DNA/polyAn生物传感器，其特征在于，所述二抗标记的金纳米颗的制备方法如下：将40～60μL稀释后的Fc区二抗与400～500μL金纳米颗粒溶液混合后孵育后离心，冲洗，取沉淀物溶解于PBS中备用。8.一种GE/DNA/polyA
n
生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：1)GE/polyA
n
和GE/BSA电极的制备：将polyA
n
溶液和BSA缓冲液分别滴于抛光的金电极表面，孵育，冲洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张乔轩，黄宪章，白开，吴梅燃，严君，韩丽乔，展敏，张鹏伟，王建兵，林海标，柯培锋，庄俊华，
申请(专利权)人：广东省中医院广州中医药大学第二附属医院，广州中医药大学第二临床医学院，广东省中医药科学院，
类型：发明
国别省市：