一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂及方法技术

本发明专利技术提供了一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂，包括：第一标记物标记的cTnI适配体和第二标记物标记的辣根过氧化物酶共价连接物；所述第一标记物和第二标记物可结合。本发明专利技术还提供了检测试剂的应用、检测试剂盒以及检测方法。本发明专利技术以cTnI适配体代替信号抗体对cTnI进行检测，核酸适配体作为分子识别元件具有体外合成简单、稳定性良好、易于序列设计与修饰等诸多优良特性，从而在保证灵敏度的基础上降低了制备难度，无需复杂且高成本的DNA扩增技术以及纳米材料合成与修饰，方法简单且成本低。进一步的，本申请在信号适配体溶液中加入白蛋白作为支持剂，显著提高了该方法的灵敏度、重复性、复杂样品适用性以及稳定性。复杂样品适用性以及稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂及方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂及方法。

技术介绍

[0002]心血管疾病(如心肌梗塞)的早期诊断对于提高患者生存率以及病后生存质量至关重要。近十几年来，人们不断开发出针对各种心血管疾病生物标志物的简单、灵敏、快速检测方法。基于抗体的酶联免疫吸附测定(enzyme
‑
linked immunosorbent assay，ELISA)是目前市场上最常见的疾病标志物检测策略，其基本步骤是：将一抗体(捕获抗体)通过吸附包被在固定相上，依次加入待测抗原目标物以及生物酶标记的另一抗体(信号抗体)，进而形成捕获抗体
‑
抗原
‑
信号抗体的三明治结构，最后利用酶催化反应产生有色产物并借助于紫外分光光度计或者酶标仪标定抗原的含量。
[0003]心肌肌钙蛋白I(cTnI)是其中一种可反映早期心肌损伤的重要生物标志物。近年来，人们筛选获得了多条cTnI适配体，报道了用于检测cTnI的适配体传感方法与器件，采用了紫外吸收、荧光、拉曼、电化学发光以及电化学等诸多信号读取方式，并且引入纳米材料以及DNA扩增技术进一步提高了检测灵敏度。然而，人们在追求高灵敏度的同时也面临诸多问题，如复杂的界面修饰与操作过程，不稳定微纳米材料制备、修饰与使用等，这些严重削弱了适配体方法或器件的重复性与未来商业化的可能性。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种灵敏度高、重复性好且稳定性好的心肌肌钙蛋白I的检测试剂及方法。
[0005]核酸适配体是一种人工筛选出来能够特异性结合配体(如蛋白质、小分子等)的DNA或者RNA链，其与配体的结合常数可达到纳摩尔甚至皮摩尔水平，与单克隆抗体相当，其可以与抗体同时对目标配体进行识别结合，又可以称之为杂化识别。
[0006]相较于基于抗体的ELISA方法，核酸适配体作为分子识别元件因具有体外合成简单、稳定性良好、易于序列设计与修饰等诸多优良特性，因此结合成熟的核酸化学合成技术，人们研发了基于核酸适配体的生物标志物检测方法。本申请在成熟的酶联免疫吸附测定方法基础上，将其中的信号抗体替换为信号适配体，构建了一种用于检测cTnI的基于抗体与适配体杂化识别的分析方法，并首次通过在信号适配体溶液中额外引入支持蛋白质，获得了能够有效提高该杂化检测方法灵敏度、重复性以及复杂样品实用性的有效路径。
[0007]本专利技术提供了一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂，包括：第一标记物标记的cTnI适配体和第二标记物标记的辣根过氧化物酶共价连接物；
[0008]所述第一标记物和第二标记物可结合。
[0009]本专利技术以cTnI适配体代替信号抗体对cTnI进行检测，灵敏度高、重复性好且稳定性好。
[0010]在一些可能的实现方式中，所述检测试剂还包括支持剂，所述支持剂选自牛血清
白蛋白。本申请专利技术人意外地发现，在以cTnI适配体代替信号抗体的基础上，向cTnI适配体溶液中加入白蛋白，尤其是牛血清白蛋白(BSA)能够极大地促进适配体与捕获抗体对cTnI的分子识别，从而进一步提高检测的灵敏度。
[0011]在一些可能的实现方式中，所述支持剂选自白蛋白，例如牛血清白蛋白、人血清白蛋白等。在一些可能的实现方式中，所述支持剂的工作浓度为0.002％～5％。在一些可能的实现方式中，所述支持剂的工作浓度为0.02％～5％。在一些可能的实现方式中，所述支持剂的工作浓度为0.2％～2％。在一些可能的实现方式中，所述支持剂的工作浓度为2％。
[0012]本专利技术提供的检测试剂还包括：捕获抗体；酶催化反应物；稀释液；清洗剂；封闭剂和反应终止液。
[0013]在一些可能的实现方式中，所述第一标记物选自生物素；所述第二标记物选自链霉亲和素。生物素和链霉亲和素可以结合从而使得cTnI适配体与辣根过氧化物酶连接生成信号适配体。
[0014]本申请对所述cTnI适配体没有特殊限制，优选具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的碱基序列。其中，SEQ ID No.1所示的序列具体为：
[0015]5'
‑
TTTTTTCGCATGCCAAACGTTGCCTCATAGTTCCCTCCCCGTGTCC
‑
3'；
[0016]SEQ ID No.2所的序列具体为：
[0017]5'
‑
TTTTTTCGTGCAGTACGCCAACCTTTCTCATGCGCTGCCCCTCTTA
‑
3'。
[0018]在一些可能的实现方案中，所述酶催化反应物选自过氧化氢(H2O2)和3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(TMB)；所述稀释液选自PBS稀释液；所述清洗剂选自吐温20；所述封闭剂选自牛血清白蛋白；所述反应终止液选自2M硫酸。
[0019]在一些具体的实现方案中，用于检测cTnI的试剂组成的一个典型组成为：捕获抗体；生物素标记的cTnI适配体(Biotin
‑
apt)；链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶共价连接物(S
‑
HRP)；酶催化反应物TMB和H2O2；稀释液PBS溶液；清洗剂吐温20；封闭剂牛血清白蛋白、反应终止液2M硫酸和支持剂牛血清白蛋白。
[0020]其中，所述PBS溶液包括10mM磷酸盐和137mM NaCl，pH值为7.2～7.4；
[0021]所述捕获抗体的工作浓度为3μg/mL，溶剂为PBS溶液；
[0022]所述生物素标记的cTnI适配体的工作浓度为20nM，溶剂为PBS溶液；
[0023]所述链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶共价连接物的工作浓度为0.55μg/mL，溶剂为PBS溶液；
[0024]所述酶催化反应物TMB的工作浓度为2.16mM，溶剂为20mM H2SO4；H2O2的工作浓度为0.035％，溶剂为乙酸缓冲溶液(0.14M,pH 5.8)；
[0025]所述清洗剂的工作浓度为0.05％，溶剂为PBS溶液；
[0026]封闭剂牛血清白蛋白的工作浓度为10％，溶剂为PBS溶液；
[0027]支持剂牛血清白蛋白的工作浓度为2％，溶剂为PBS溶液。
[0028]在上述试剂中，牛血清白蛋白同时作为封闭剂和支持剂，使用时机和所起作用不同：牛血清白蛋白作为支持剂加入到生物素标记的cTnI适配体和链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶共价连接物形成的信号适配体溶液中，用于提高检测灵敏度；作为封闭剂加入到结合有捕获抗体的高结合力孔板中，用于封闭孔板上的未反应结合位点。
[0029]本专利技术还提供了一种试剂盒，包括上述技术方案所述的试剂。
[0030]本专利技术提供的试剂及试剂盒的检测原理如图1所示，图1为本专利技术提供的试剂进行检测的原理示意图：捕获抗体通过吸附被包被在高结合力96孔板基底上，然后加入cTnI与信号适配体混合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂，包括：第一标记物标记的cTnI适配体和第二标记物标记的辣根过氧化物酶共价连接物；所述第一标记物和第二标记物可结合。2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，还包括支持剂，所述支持剂选自白蛋白。3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述支持剂选自牛血清白蛋白。4.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述支持剂的工作浓度为0.002％～5％。5.根据权利要求1～4任意一项所述的检测试剂，其特征在于，还包括：捕获抗体；酶催化反应物；稀释液；清洗剂；封闭剂和反应终止液。6.根据权利要求5所述的检测试剂，其特征在于，所述第一标记物选自生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：任江涛，呼思乐，何柳，汪尔康，李敬，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：