一种以CD63为靶点促进细胞分泌外泌体的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种以CD63为靶点促进细胞分泌外泌体的方法及应用。本发明专利技术提供了一种提高外泌体产量的方法，包括如下步骤：以CD63为靶点对用于分泌外泌体的供体细胞进行改造；所述改造为提高所述供体细胞中CD63的表达量。本发明专利技术方法获得的细胞外泌体具有产量更高的特点。通过在外泌体生产细胞过表达CD63促进细胞外泌体分泌，解决传统依靠细胞分泌外泌体产量低的问题，单位细胞外泌体的产量可提高8倍，且具有正常外泌体的大小和形态，可以作为蛋白和核酸类药物的药物载体介导细胞递送。核酸类药物的药物载体介导细胞递送。

【技术实现步骤摘要】
一种以CD63为靶点促进细胞分泌外泌体的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种以CD63为靶点促进细胞分泌外泌体的方法及应用。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(EVs)是由细胞在正常生理条件或在刺激后分泌的脂质双层封闭膜结构，包含不同大小和亚细胞膜来源的囊泡，外泌体是指大小范围为40
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200nm的细胞外囊泡子集。外泌体作为细胞通讯的信号体，可以通过与受体细胞膜相互作用，或通过被细胞摄取后释放内容物来介导信号转导。这一特征使外泌体成为发展潜力巨大的基因和蛋白药物载体。然而单位体积的细胞条件性培养基中外泌体的量较低，产业化量产的材料耗费与时间成本高，因此目前亟需有效提高外泌体获得率的方法。提高外泌体量产的一种方法是开发大规模细胞培养平台，而另一种方法则专注通过细胞刺激增加每个细胞的颗粒产量，例如通过缺氧、超声刺激等施加适度的细胞生长压力或利用化合物干扰溶酶体小囊运输和诱导晚期内体隔室的空泡化增加外泌体分泌。然而既能刺激外泌体产生又不影响细胞活性和生长的培养条件或化合物较为缺乏，因此研发提高外泌体的产量对于外泌体的转化意义重大。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种以CD63为靶点促进细胞分泌外泌体的方法及应用。
[0004]第一方面，本专利技术要求保护一种提高外泌体产量的方法(或者一种制备外泌体的方法)。
[0005]本专利技术所要求保护的提高外泌体产量的方法(或者制备外泌体的方法)是一种在常规细胞培养条件下提高细胞培养基上清中外泌体产量的方法，可包括如下步骤：以CD63为靶点对用于分泌外泌体的供体细胞进行改造。
[0006]其中，所述改造为提高所述供体细胞中CD63的表达量。
[0007]进一步地，提高所述供体细胞中CD63的表达量可通过向所述供体细胞中导入能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质来实现。
[0008]更进一步地，所述方法可包括如下步骤：
[0009](A1)向所述供体细胞中导入能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质，得到重组细胞；
[0010](A2)用无血清培养基培养所述重组细胞，收集培养上清；
[0011](A3)将所述培养上清与聚乙二醇6000溶液混悬离心，所得沉淀物中即含有外泌体。
[0012]在步骤(A1)中，所述“能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质”可为如下任一：
[0013](B1)用于表达CD63的重组载体；
[0014](B2)用于表达CD63的mRNA或所述mRNA的化学修饰物；
[0015](B3)含有(B1)所述重组载体或(B2)所述mRNA或所述mRNA的化学修饰物的脂质颗粒；
[0016](B4)含有(B1)所述重组载体或(B2)所述mRNA或所述mRNA的化学修饰物的重组微生物。
[0017]在步骤(A1)中，在向所述供体细胞中导入所述“能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质”后，还可包括利用抗生素或荧光蛋白标签对细胞进行筛选从而获得重组细胞的步骤。
[0018]在本专利技术的具体实施方式中，是采用荧光蛋白标签对细胞进行筛选的，具体采用的是绿色荧光蛋白标签(eGFP)。
[0019]在步骤(A2)中，用所述无血清培养基培养所述重组细胞获得所述培养上清是按照包括如下步骤的方法进行的：用所述无血清培养基培养所述重组细胞，在培养的第3、5、7天收集细胞(如HEK293T)条件培养基上清，在第3天和第5天收集条件培养基上清后，加入新鲜的无血清培养基继续培养。收集一周的培养基上清后进行外泌体的富集纯化。
[0020]在步骤(A3)中，在将所述培养上清与聚乙二醇6000溶液混悬离心前还可包括用差速离心法去除所述培养上清中的细胞和细胞碎片的步骤。进一步地，去除所述培养上清中细胞的离心条件可为300
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500g(如300g)离心5min；去除所述培养上清中细胞碎片的离心条件可为3900
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4000g(如3900g)4℃离心20min。
[0021]在步骤(A3)中，所述聚乙二醇6000溶液中聚乙二醇6000的浓度可为300g/L。
[0022]在步骤(A3)中，所述培养上清与所述聚乙二醇6000溶液的体积配比为2:1。4℃混合过夜。
[0023]在步骤(A3)中，所述离心的条件可为3900
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4000g(如3900g)4℃离心30min。
[0024]在步骤(A3)之后还可包括将所述沉淀物用生理盐水重悬后用超速离心(150000
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170000g，如150000g 4℃离心2h)对外泌体进行进一步纯化的步骤。然后可以将获得的外泌体重新悬浮在生理盐水(0.9％NaCl溶液)或无菌PBS溶液中，短期(1
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2天)储存于4℃，长期(>2天)分装放入
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80℃冰箱保存。
[0025]在所述方法中，所述供体细胞可为人源细胞或其他哺乳动物细胞。进一步地，所述供体细胞可为HEK293细胞、HEK293T细胞、CHO细胞、间充质干细胞或脂肪细胞等。在本专利技术的具体实施方式中，所述供体细胞为HEK293T细胞。
[0026]在所述方法中，所述重组载体可为重组慢病毒表达载体、重组真核表达载体。所述重组微生物可为重组慢病毒、重组腺相关病毒。在本专利技术的具体实施方式中，所述重组载体为用于重组慢病毒包装的包括包装质粒、包膜质粒、目的基因质粒三种质粒载体，其中所述目的基因质粒的主要元件结构如下：PGMLV
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CMV
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CD63
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eGFP
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3xFlag
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PGK
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Puro,其载体全序列如SEQ ID No.4所示。
[0027]在所述方法中，所述mRNA的化学修饰物是对所述mRNA进行化学修饰得到的物质；所述化学修饰可以包括选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种的组合。
[0028]在本专利技术中，所述CD63的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述CD63基因的核苷酸序列可为人CD63 mRNA逆转录的cDNA(如SEQ ID No.3)，也可为密码子优化的表达CD63相同氨基酸序列的核酸序列(如SEQ ID No.2)。
[0029]第二方面，本专利技术要求保护用于制备外泌体的成套产品。
[0030]本专利技术要求保护的用于制备外泌体的成套产品包括前文第一方面中所述的“能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质”、所述供体细胞、所述无血清培养基、聚乙二醇6000。
[0031]进一步地，所述成套产品中还可包括生理盐水或PBS溶液，离心机等。
[0032]第三方面，本专利技术要求保护如下任一应用：
[0033](C1)前文第一方面中所述的“能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质”或前文第二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高外泌体产量的方法，包括如下步骤：以CD63为靶点对用于分泌外泌体的供体细胞进行改造。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述改造为提高所述供体细胞中CD63的表达量。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：提高所述供体细胞中CD63的表达量通过向所述供体细胞中导入能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质实现。4.根据权利要求1
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3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(A1)向所述供体细胞中导入能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质，得到重组细胞；(A2)用无血清培养基培养所述重组细胞，收集培养上清；(A3)将所述培养上清与聚乙二醇6000溶液混悬离心，所得沉淀物中即含有外泌体。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质为如下任一：(B1)用于表达CD63的重组载体；(B2)用于表达CD63的mRNA或所述mRNA的化学修饰物；(B3)含有(B1)所述重组载体或(B2)所述mRNA或所述mRNA的化学修饰物的脂质颗粒；(B4)含有(B1)所述重组载体或(B2)所述mRNA或所述mRNA的化学修饰物的重组微生物。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：步骤(A1)中，在向所述供体细胞中导入能够增加所述供体细胞中CD63基因表达的物质后，还包括利用抗生素或荧光蛋白标签对细胞进行筛选从而获得重组细胞的步骤；和/或步骤(A3)中，在将所述培养上清与聚乙二醇6000溶液混悬离心前还包括用差速离心法去除所述培养上清中的细胞和细胞碎片的步骤；进一步地，去除所述培养上清中细胞的离心条件为300
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500g离心5min；去除所述培养上清中细胞碎片的离心条件为3900
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40...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵君棠，沈玉先，李诗雨，许寒杨，朱旭，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：