猪精液冷冻保护剂、制备方法、冷冻及解冻方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪精液冷冻保护剂、制备方法、冷冻及解冻方法和应用，涉及猪精液冷冻保护技术领域。所述冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，所述渗透性冷冻保护剂包括甘油、DMSO和异丙醇；所述非渗透性冷冻保护剂包括PVP、吐温20、Triton

【技术实现步骤摘要】
猪精液冷冻保护剂、制备方法、冷冻及解冻方法和应用


[0001]本申请涉及猪精液冷冻保护
，具体涉及一种猪精液冷冻保护剂、制备方法、冷冻及解冻方法和应用。

技术介绍

[0002]当前养猪业碰到很大的困难，需要在活体保种之外探索一些技术方法来遗传资源。2019年悉尼大学使用了50多年前冷冻的美利奴公羊的精液给56只母羊进行体外受精，其中34只母羊成功受孕，受孕率达到61％，并且没有发现使用冷冻精子的受孕率随着冷冻时间的延长而下降的现象。该方法的成功为养猪业的精子保种提供了思路。但猪一次射精量很大(约300ml)，在进行精液冷冻的时候，会遇到慢速冷冻损伤和快速冷冻损伤的问题。
[0003]常见的猪冷冻精液稀释液都是基于甘油
‑
卵黄保护剂进行开发的，开发的思路是在两种损伤之间寻找平衡点，使损伤的总和达到最小，得到最大的冷冻生存率。然而，此种冷冻保护方式精液的损伤仍然相对较大，且冷冻方法复杂。
[0004]因此，业内亟需研发一种猪精液冷冻保护剂及其制备方法和冷冻、解冻方法，克服冷冻精子过程中慢速冷冻损伤和快速冷冻损伤的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供的一种猪精液冷冻保护剂、制备方法、冷冻及解冻方法和应用，旨在解决上述
技术介绍
中，在进行猪精液冷冻的时候，会遇到慢速冷冻损伤和快速冷冻损伤的问题。
[0006]为了实现上述技术目的，本专利技术主要采用如下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术公开了一种猪精液冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，所述渗透性冷冻保护剂包括甘油、DMSO和异丙醇；所述非渗透性冷冻保护剂包括PVP、吐温20、Triton
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100和SDS，且渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂的体积比为1:1。
[0008]在一些实施例中，所述冷冻保护剂还包括TRIS稀释液，各成份在冷冻保护剂中所占的百分比为：甘油5％
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7％v/v、DMSO 3％
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5％v/v、异丙醇1％
‑
2％v/v、PVP 3％
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5％g/v、吐温20 0.3
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0.6％v/v、Triton
‑
100 0.1％v/v、SDS 5％
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8％v/v，余量为TRIS稀释液；所述TRIS稀释液中各成分及含量为：
[0009]成分质量TRIS2.44g柠檬酸一水合物1.36g葡萄糖0.82g蛋黄20.0mlPolymixin B硫酸盐100,000IU超纯水100.0ml
渗透压(mOsm kg21)301.0pH值6.55
[0010]第二方面，本专利技术公开了一种猪精液冷冻保护剂的制备方法，将渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂混合均匀后，添加到TRIS稀释液中稀释，即得。
[0011]第三方面，本专利技术公开了一种利用第一方面所述的冷冻保护剂冷冻猪精液的方法，包括如下步骤：
[0012]步骤1：将猪精液稀释预处理后离心，弃去上清液，然后加入TRIS稀释液，使得0.5ml精液中含精子为5亿；
[0013]步骤2：向步骤1得到的精液中加入冷冻保护剂，使得1ml精液中含精子为5亿；
[0014]步骤3：将步骤2得到的精液灌装到细管中，并用液氮熏蒸法(－150℃)进行冷冻，然后迅速投入液氮保存。
[0015]在一些实施例中，所述猪精液稀释预处理步骤如下：调节猪精液稀释剂温度，使猪精液稀释剂与猪精液之间的温度差异在
±
1℃内，然后向猪精液中加入等体积的猪精液稀释剂，于16℃～18℃冷藏。
[0016]进一步的，所述液氮熏蒸法包括如下步骤：
[0017]将装有猪精液的细管放入载有浮漂的冷冻装置内，所述浮漂上固定安装有支架，所述细管放入所述支架内，所述冷冻装置内装有液氮；
[0018]向浮漂施加外力，使支架浸入液氮液面之下，利用液氮冷冻支架上细管内猪精液，冷冻5分钟到7分钟。
[0019]第四方面，本专利技术公开了一种解冻猪精液的方法，包括如下步骤：取出液氮中的冷冻精液，并置于30℃～36℃恒温水浴锅中解冻，解冻后将精液加入到BTS稀释液中，使精液最终配种所需浓度为30mL～50mL BTS液稀释液中含精子10亿～90亿。
[0020]在一些实施例中，所述BTS稀释液中各成分及含量为：
[0021][0022][0023]第五方面，本专利技术公开了一种如第一方面所述的猪精液冷冻保护剂或由第二方面制备得到的猪精液冷冻保护剂或由第三方面所述的冷冻猪精液的方法在冷冻猪精液过程中的应用。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0025]1、本专利技术利用渗透性冷冻保护剂与非渗透性冷冻保护剂联合使用，可以充分保护精子的顶体、线粒体完整性，提高精子配种率，解冻后精液活力优于其它猪冻精。非渗透性冷冻保护与卵黄中油脂一起防止精子细胞在冷冻过程中过渡暴露在高浓度溶质环境或过度收缩，引起损伤。TRIS
‑
柠檬酸调节溶液pH值。渗透性冷冻保护剂减少了精子在冷冻过程中水分子形成的冰晶，使精子不会被超低温破坏结构，降低了精子的死亡。
[0026]2、将本专利技术的稀释剂用于猪冷冻精液的生产，解冻后精子活力达85％以上，顶体完整率达85％以上，质膜完整率80以上，线粒体活性达80％以上，畸形率10％以下。
附图说明
[0027]图1为本申请中公开的液氮熏蒸法使用的装置图。
具体实施方式
[0028]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0029]1、溶液的配置及筛选：
[0030]TRIS稀释液按下列表1中配方1
‑
4的组分含量进行配制筛选。
[0031]表1TRIS稀释液
[0032][0033]Beltsville解冻溶液(BTS)按下列表2中配方5
‑
9的组分含量进行配制筛选。
[0034]表2Beltsville解冻溶液(BTS)
[0035][0036][0037]2、猪冷冻精液保护剂的制备：
[0038]将渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂混合均匀后，添加到TRIS稀释液中稀释，即得。
[0039]其中，渗透性冷冻保护剂包括甘油、DMSO和异丙醇；非渗透性冷冻保护剂包括PVP、吐温20、Triton
‑
100和SDS。经过TRIS稀释液稀释后的保护剂中，各成份在冷冻保护剂中所占的百分比为：甘油5％
‑
7％v/v、DMSO 3％
‑
5％v/v、异丙醇1％
‑
2％v/v、PVP 3％
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5％g/v、吐温20 0.3
‑
0.6％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪精液冷冻保护剂，其特征在于：所述冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，所述渗透性冷冻保护剂包括甘油、DMSO和异丙醇；所述非渗透性冷冻保护剂包括PVP、吐温20、Triton
‑
100和SDS，且渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂的体积比为1:1。2.根据权利要求1所述的猪精液冷冻保护剂，其特征在于：所述冷冻保护剂还包括TRIS稀释液，各成份在冷冻保护剂中所占的百分比为：甘油5％
‑
7％v/v、DMSO 3％
‑
5％v/v、异丙醇1％
‑
2％v/v、PVP 3％
‑
5％g/v、吐温20 0.3
‑
0.6％v/v、Triton
‑
100 0.1％v/v、SDS 5％
‑
8％v/v，余量为TRIS稀释液；所述TRIS稀释液中各成分及含量为：成分质量TRIS2.44g柠檬酸一水合物1.36g葡萄糖0.82g蛋黄20.0mlPolymixin B硫酸盐100,000IU超纯水100.0ml渗透压(mOsm kg21)301.0pH值6.553.一种猪精液冷冻保护剂的制备方法，其特征在于：将渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂混合均匀后，添加到TRIS稀释液中稀释，即得。4.一种利用权利要求1
‑
2任一项所述的冷冻保护剂冷冻猪精液的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：将猪精液稀释预处理后离心，弃去上清液，然后加入TRIS稀释液，使得0.5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖红卫，华再东，张立苹，陈矾，周昌繁，任红艳，毕延震，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：