死亡受体激动剂在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途及一种验证该用途的模型制造技术

本发明专利技术公开了一种死亡受体激动剂在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途，一种验证模型，包括如下步骤：(1)sgRNA的设计和合成；(2)Cas9mRNA合成：采用T3质粒pT3TS

【技术实现步骤摘要】
死亡受体激动剂在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途及一种验证该用途的模型


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种死亡受体激动剂Bioymifi在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途及耳聋动物模型的建立方法，用于耳聋治疗。

技术介绍

[0002]听力损失是人类最常见的感觉障碍之一，目前全球五分之一的人正受到不同程度的听力损失问题。大部分的听力损失是由于毛细胞的功能异常和毛细胞死亡造成的。与鱼类为代表的非哺乳动物毛细胞可以在损伤后通过支持细胞分化的方式恢复到正常水平不同，成体哺乳动物包括人类的毛细胞损伤后永久无法再生。因此，可以说目前毛细胞死亡导致的耳聋仍是无法治愈的，所以探索附属细胞的增殖分化为毛细胞是耳聋治疗的重要思路。
[0003]Bioymifi最初是作为一种抗癌的小分子药物被开发的，是TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)类似物，用于激活死亡受体(DR)。Bioymifi与DR4/5结合，诱导其发生聚集，招募FADD，FADD又招募caspase
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8/10前体，在膜内构成了DISC，在DISC内蛋白酶被激活，活性的caspase8/10随后被释放到细胞质中，切割活化caspase
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3/7前体，最后使癌细胞凋亡得以执行。另外，该信号也通过线粒体发挥作用，caspase8/10启动Bid的裂解加工(Bcl
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2家族成员的一促凋亡成员)，导致Bid的截断形式易位到线粒体，从而诱导Bax和Bak的激活，导致细胞色素c从线粒体释放。细胞色素c反过来激活凋亡小体，在凋亡小体中，另一个启动子caspase caspase9被招募和激活。与caspase8和caspase10一样，活性的caspase9也能切割效应体caspase并诱导其激活，从而实现细胞凋亡。
[0004]专利技术人发现Bioymifi可以导致斑马鱼侧线神经丘毛细胞和支持细胞细胞显著增多，而并没有导致毛细胞的死亡。且这种促进毛细胞增多现象在敲除死亡受体的斑马鱼中消失了，这暗示Bioymifi可能是一种促进毛细胞或其附属细胞再生的重要候选药物。所以很有可能在不同细胞中Bioymifi激活TRAIL受体达到的效果是不同的。但是目前对于Bioymifi促进不同细胞再生的研究和发现还可以进一步提高，尤其Bioymifi和其类似物TRAIL在毛细胞及其附属细胞中的作用也是未知的。
[0005]关于动物模型：专利技术人采用斑马鱼的侧线神经丘建立了一套高效和易操作的毛细胞再生药物和基因鉴定的技术流程。鱼类侧线感受器是目前研究毛细胞的可靠三大动物模型之一。侧线毛细胞如内耳毛细胞一样，来自头部神经基板，与哺乳类毛细胞具有相似的发育分化模式、相似的结构和相似调控机制，已被认为一定程度上可以模拟各类人类听力健康问题；且斑马鱼侧线感受器(神经丘)位于体表，其中的毛细胞可以被YO
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PRO
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1特异性染色，便于观察、计数；最后，对比培养周期较长的小鼠，5dpf仔鱼的侧线毛细胞已经基本与成鱼相同，因此它是一个理想而高效的毛细胞挽救与再生药物检测模型。
[0006]申请人提出小分子药物Bioymifi作为一种TRAIL受体激动剂在促毛细胞及附属细胞增殖以治疗耳聋的新可能，欲为人类健康事业作出贡献。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种死亡受体激动剂Bioymifi在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途，及建立一套高效和高通量的毛细胞再生研究动物模型，为开发全新的毛细胞再生靶点和药物提供支持。
[0008]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0009]死亡受体激动剂Bioymifi在促进毛细胞再生以治疗耳聋的应用。
[0010]作为优选实施例，所述激动剂Bioymifi为小分子化合物。
[0011]作为优选实施例，所述Bioymifi的给药方式为浸泡给药。
[0012]作为优选实施例，所述毛细胞分布于动物的耳蜗、前庭和侧线感受器中，具有感受机械振动的功能，在听觉和平衡中发挥关键作用，毛细胞的顶端具有一根动纤毛和多根阶梯状排布的静纤毛，静纤毛上分布着机械敏感离子通道，毛细胞的基底面通过突触与听神经或侧线神经相连，毛细胞的再生为周围的支持细胞被Bioymifi激活重新进入细胞周期，启动细胞增殖，增殖的支持细胞受到Notch等信号通路的作用并最终分化为毛细胞。
[0013]作为优选实施例，所述耳聋为毛细胞受到药物、噪音或衰老的因素刺激损伤缺失导致的，而非由遗传导致毛细胞功能蛋白异常引发的耳聋。
[0014]作为优选实施例，鱼类侧线毛细胞模型可以一定程度上模拟耳内注射给药场景，药物溶解在溶剂中直接接触细胞，避免大部分药物难以过血脑屏障而导致给药效果不佳的问题。
[0015]一种验证模型，包括如下步骤：
[0016](1)sgRNA的设计和合成；
[0017](2)Cas9 mRNA合成：采用T3质粒pT3TS
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nlsCas9nls，通过XbaI限制性内切酶(Thermo fisher)将质粒进行线性化处理，产物用普通DNA产物纯化试剂盒进行纯化，运用mMessage mMachine T3Transcription Kit的体外转录试剂盒，以线性化质粒作为模板进行体外转录获得Cas9 mRNA，最终产物用RNA Clean&Concentrator Kit纯化，保存于
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80℃；
[0018](3)显微注射和基因分型：收集1
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2细胞期的斑马鱼胚胎，进行显微注射操作，利用显微注射仪将混合液通过显微注射针注射到细胞质中，混合液为Cas9和sgRNA混合液，每颗卵注射量约为1.4nl(含150
‑
300pg Cas9 mRNA和50pg sgRNA)，注射后将胚胎转移至幼鱼培养液中，28.5℃培养箱中恒温培养，及时吸除死卵，保持培养液清洁，利用注射后培养至24hp以上的胚胎或者成鱼的部分鱼尾组织进行碱裂解法提取DNA，将组织置于PCR管中，加10μl 50mM NaOH溶液进行裂解，反应条件为95℃孵育20min，然后加入10μL 100mM Tris
‑
HCl(PH为8.0)，混匀后用ddH2O稀释10倍，以此为PCR模板，进行PCR(引物序列(5
’‑3’
)
[0019]qPCR
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tnfrsfa
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F：AAACTCCTCCCTTTGCTCGG；qPCR
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tnfrsfa
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R：TACCCGCAAGAGGTCGTAGA)，反应程序为95℃变性10min，95℃变性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸30sec，72℃延伸10min，4℃保存，循环数为35个循环，最后将PCR产物送生工生物工程公司进行毛细管电泳检测，判断敲除效率；
[0020](4)验证阶段本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.死亡受体激动剂在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途，其特征在于，死亡受体激动剂Bioymifi在促进毛细胞再生以治疗耳聋的应用。2.根据权利要求1所述的死亡受体激动剂在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途，其特征在于，所述激动剂Bioymifi为小分子化合物。3.根据权利要求1所述的死亡受体激动剂在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途，其特征在于，所述Bioymifi的给药方式为浸泡给药。4.根据权利要求1所述的死亡受体激动剂在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途，其特征在于，所述毛细胞分布于动物的耳蜗、前庭和侧线感受器中，具有感受机械振动的功能，在听觉和平衡中发挥关键作用，毛细胞的顶端具有一根动纤毛和多根阶梯状排布的静纤毛，静纤毛上分布着机械敏感离子通道，毛细胞的基底面通过突触与听神经或侧线神经相连，毛细胞的再生为周围的支持细胞被Bioymifi激活重新进入细胞周期，启动细胞增殖，增殖的支持细胞受到Notch等信号通路的作用并最终分化为毛细胞。5.根据权利要求1所述的死亡受体激动剂在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途，其特征在于，所述耳聋为毛细胞受到药物、噪音或衰老的因素刺激损伤缺失导致的，而非由遗传导致毛细胞功能蛋白异常引发的耳聋。6.根据权利要求1所述的死亡受体激动剂在促进毛细胞再生以治疗耳聋的新用途，其特征在于，鱼类侧线毛细胞模型可以一定程度上模拟耳内注射给药场景，药物溶解在溶剂中直接接触细胞，避免大部分药物难以过血脑屏障而导致给药效果不佳的问题。7.一种验证模型，包括如下步骤：(1)sgRNA的设计和合成；(2)Cas9 mRNA合成：采用T3质粒pT3TS
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nlsCas9nls，通过XbaI限制性内切酶(Thermo fisher)将质粒进行线性化处理，产物用普通DNA产物纯化试剂盒进行纯化，运用mMessage mMachine T3 Transcription Kit的体外转录试剂盒，以线性化质粒作为模板进行体外转录获得Cas9 mRNA，最终产物用RNA Clean&Concentrator Kit纯化，保存于
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80℃；(3)显微注射和基因分型：收集1
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2细胞期的斑马鱼胚胎，进行显微注射操作，利用显微注射仪将混合液通过显微注射针注射到细胞质中，混合液为Cas9和sgRNA混合液，每颗卵注射量约为1.4nl(含150
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300pg Cas9 mRNA和50pg sgRNA)，注射后将胚胎转移至幼鱼培养液中，28.5℃培养箱中恒温培养，及时吸除死卵，保持培养液清洁，利用注射后培养至24hp以上的胚胎或者成鱼的部分鱼尾组织进行碱裂解法提取DNA，将组织置于PCR管中，加10μl 50mM NaOH溶液进行裂解，反应条件为95℃孵育20min，然后加入10μL 100mM Tris
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HCl(PH为8.0)，混匀后用ddH2O稀释10倍，以此为PCR模板，进行PCR(引物序列(5
’‑3’
)qPCR
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F：AAACTCCTCCCTTTGCTCGG；qPCR
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【专利技术属性】
技术研发人员：范纯新，杨佳颖，王建，袁小艺，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：