一种生物矿化包被细菌的制备方法、生物矿化包被细菌及其应用技术

本发明专利技术提供了一种生物矿化包被细菌的制备方法、生物矿化包被细菌及其应用，涉及微生物药物制备技术领域，一种生物矿化包被细菌的制备方法包括以下步骤：细菌与聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，得细菌悬浮液；将CaCl2溶液与细菌悬浮液混合，然后加入Na2CO3水溶液；搅拌0.5～1.5h，离心，收集沉淀获得生物矿化细菌。通过简便的静电相互作用辅助生物界面矿化的方法，以沉积一种超抗性和自适应的细菌保护涂层，对于包被包括专性和兼性厌氧菌在内的多种物种是通用的，并且制备程序和形成的涂层对细菌活力的影响可以忽略不计，免除细菌遭受胃酸和胆汁酸的双重侵害，保证细菌到达肠道时的活力和数量。量。量。

【技术实现步骤摘要】
一种生物矿化包被细菌的制备方法、生物矿化包被细菌及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物药物制备
，尤其涉及一种生物矿化包被细菌的制备方法、生物矿化包被细菌及其应用。

技术介绍

[0002]肠道微生物组由大量微生物组成，已被证明对维持宿主健康至关重要。深入的研究表明，肠道微生物平衡的破坏会导致肠道稳态受损，随后引发多种疾病。补充有益微生物通常被用作预防和治疗疾病的有吸引力的策略，因为引入的物种可以减少病原体定植并保持健康的微生物组成。凭借出色的患者依从性，将益生菌口服递送至肠道微生物组因其无创性而成为最有吸引力的补充方法。微生物生物疗法有效性的一个关键步骤是要求在制造过程中具有活力，并在口服递送至肠道后保持足够数量。因此，迫切需要保护方法来制备口服活生物治疗药物。
[0003]目前，已利用干粉和肠溶衣和丸剂的形成以及乳清、甘油、海藻糖、胃蛋白酶和其他保护剂的添加来减少对细菌疗法的环境威胁。已探索使用藻酸盐、壳聚糖、纤维素、金属酚醛网络和金属有机框架对整个涂层进行单独封装，作为物理保护细菌免受外部攻击的有效工具。例如，用额外的自组装脂质膜进行涂层赋予细菌抵抗胃肠道相关威胁的能力。然而，现有方法制备的口服生物治疗药物在从细菌培养到到达肠道定植的整个过程中，都面临着一些不可避免的困难，导致可用性极低。
[0004]在制造过程中，首先暴露于氧气会对厌氧菌的酶和核酸产生毒性，厌氧菌代表了绝大多数有益微生物。其次，为了确保安全和降低潜在的污染风险，治疗产品经常进行灭菌处理，导致细胞应激、细胞结构改变，甚至细菌细胞死亡。最后，口服摄入后，与胃肠道相关的腔内损伤，特别是胃酸和胆汁酸，会使摄入的微生物失活，并导致到达肠道时活细胞数量不足。因此，非常需要一种能够在从制造到到达肠道进行定植的整个过程中保护微生物的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种生物矿化包被细菌的制备方法、生物矿化包被细菌以及在制备超抗性和自适应肠道口服微生物药物中的应用，免除细菌遭受胃酸和胆汁酸的双重侵害，保证细菌到达肠道时的活力和数量。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种生物矿化包被细菌的制备方法，包括以下步骤：细菌与聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，得细菌悬浮液；将CaCl2溶液与细菌悬浮液混合，然后加入Na2CO3水溶液；搅拌0.5～1.5h，离心，收集沉淀获得生物矿化细菌。
[0008]优选的，所述细菌与聚乙烯吡咯烷酮溶液的比例为1
×
107～1
×
108CFUs：1～2mL。
[0009]优选的，所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的浓度为1～3mg/mL。
[0010]优选的，所述CaCl2浓度为0.30～0.36M，所述细菌与CaCl2溶液的用量比例为1
×
107～1
×
108CFUs：0.1～0.3mL。
[0011]优选的，所述CaCl2溶液与细菌悬浮液混合后，搅拌10～30min。
[0012]优选的，所述Na2CO3水溶液的浓度为0.30～0.36M，所述Na2CO3水溶液的用量与CaCl2的用量等体积。
[0013]优选的，所述离心的转速为8000～12000rpm，所述离心的时间为0.5～1.5min。
[0014]优选的，所述离心分离生物矿化细菌后，采用PBS溶液洗涤处理2～4次。
[0015]本专利技术还提供了所述生物矿化包被细菌的制备方法制备获得的生物矿化包被细菌。
[0016]本专利技术还提供了所述的生物矿化包被细菌在制备超抗性和自适应肠道口服微生物药物中的应用。
[0017]本专利技术提供了一种生物矿化包被细菌的制备方法，通过简便的静电相互作用辅助生物界面矿化的方法，以沉积一种超抗性和自适应的细菌保护涂层，对于包被包括专性和兼性厌氧菌在内的多种物种是通用的，并且制备程序和形成的涂层对细菌活力的影响可以忽略不计；由于其物理屏障作用，由此产生的单细胞涂层赋予单独包装的厌氧菌以抵抗与制造和产品灭菌相关的损害，包括氧气暴露、紫外线照射和75％乙醇；口服后，矿物质涂层与胃酸之间自发发生复分解反应，能够实现胃内低pH值的快速中和和脱矿质触发的涂层细菌释放；同时，分解产生的钙离子会诱导胆汁酸的胶束聚集，从而使释放的细菌免受胃酸和胆汁酸的侵害，避免随后的肠道定植；在生物矿物涂层的包被下，益生菌脆弱拟杆菌菌株在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中表现出令人印象深刻的治疗效果。
附图说明
[0018]图1为生物界面矿化的示意图，其中a)在细菌表面制备矿物涂层；b)涂层细菌对环境攻击的抵抗力；c)胃酸的中和，包被的细菌的适应性释放，以及钙离子触发的胆汁酸聚集，通过口服摄入后胃肠道中的生物矿物质包衣的双分解反应；
[0019]图2为生物矿物涂层的表征图，其中a)脆弱拟杆菌BF839原生细菌和脆弱拟杆菌BF839包被细菌的代表性TEM图像，比例尺：5μm；b)脆弱拟杆菌BF839包被细菌的典型SEM图像和EDS元素映射，比例尺：1μm；c)脆弱拟杆菌BF839原生细菌和脆弱拟杆菌BF839包被细菌的FTIR光谱；d)脆弱拟杆菌BF839在不同处理后的Zeta电位；e)钙黄绿素标记的包被BF839的流式细胞术直方图；f)脆弱拟杆菌BF839包被细菌的共焦图像，绿色通道表示用钙黄绿素标记的生物矿物涂层，比例尺：8μm；
[0020]图3为生物矿物涂层的细胞相容性和多功能性图，其中a)在37℃下在GAM肉汤中培养的生长曲线；b)细胞活力；c)天然和涂层EcN的代表性TEM图像，比例尺：2μm；d)原生和包被EcN的Zeta电位；e)原生和包被Bif的典型TEM图像，比例尺：1μm；f)原生和包被Bif的Zeta电位，误差线代表标准偏差n＝3个独立实验，数据表示为平均值
±
SD；
[0021]图4为对制造相关线程的抵抗力，其中a)空气30天；c)紫外线照射30min；误差线代表标准偏差n＝3个独立实验，数据表示为平均值
±
SD；b)原生BF839对空气暴露代表性TEM图像；d)包被BF839对紫外线照射的代表性TEM图像，比例尺：2μm；e)去涂层包被BF839和原生BF839在暴露于紫外线照射30min；
[0022]图5为生物矿物涂层的自适应性图，其中a)SGF原生和包被细菌的数码照片；b)细菌数量依赖性；c)细菌的流式细胞仪直方图；d)钙黄绿素标记的包被BF839共焦图像，绿色通道是指钙黄绿素标记的矿物涂层，比例尺：8μm；e)存活细菌的数量，误差线代表标准偏差n＝3个独立实验，数据表示为平均值
±
SD；f)SGF孵育后原生和包被BF839的TEM图像，比例尺：2μm；
[0023]图6为体内抗性和自适应性，其中a)EcN的共焦图像，绿色和红色通道表示钙黄绿素标记的矿物涂层和表达mCherry的EcN，比例尺：10μm；b)胃肠道的IVIS图像，比例尺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物矿化包被细菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：细菌与聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，得细菌悬浮液；将CaCl2溶液与细菌悬浮液混合，然后加入Na2CO3水溶液；搅拌0.5～1.5h，离心，收集沉淀获得生物矿化细菌。2.如权利要求1所述的生物矿化包被细菌的制备方法，其特征在于，所述细菌与聚乙烯吡咯烷酮溶液的比例为1
×
107～1
×
108CFUs：1～2mL。3.如权利要求2所述的生物矿化包被细菌的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的浓度为1～3mg/mL。4.如权利要求1所述的生物矿化包被细菌的制备方法，其特征在于，所述CaCl2浓度为0.30～0.36M，所述细菌与CaCl2溶液的用量比例为1
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107～1
×
108CFUs：...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘尽尧，耿忠民，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：