一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法及应用，该方法采用分步骤、表面修饰法制备二氧化硅@石墨烯量子点复合纳米颗粒，再将CCRF

【技术实现步骤摘要】
一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于纳米功能材料和生物传感探针
，具体涉及一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法及其靶向双光子成像应用。

技术介绍

[0002]在精准医学时代，与肿瘤作战更讲究“关口前移”。探索一种肿瘤早期诊断及预后监测新方法，特别是通过细胞和活体水平上的非侵入式、原位、实时成像与表征揭示其发生发展过程中的规律和机制，对于患者治愈率和生存率的提高具有十分重要的意义。核酸适配体（aptamer）作为一类新型靶向识别分子，不但具有与抗体分子相当甚至更强的靶标（如：金属离子、蛋白质、细胞等）识别能力，而且还具有分子量小、合成修饰简单、耐热、无免疫原性等独特优势。因此，以aptamer为靶向识别元件，结合其它信号检测技术，构建一种灵敏度高、可实时、原位成像的荧光检测方法，能够为肿瘤的早期诊断提供强有力的工具。
[0003]双光子荧光显微成像技术兼具近红外激发、自发荧光和自吸收低、三维空间分辨率和图像对比度高、组织穿透能力强等优良特性，为疾病临床早期诊断提供了更加准确的方法。石墨烯量子点（GQDs）是一类平均粒径小于10nm的准零维荧光碳纳米材料。作为双光子纳米材料中的一种，石墨烯量子点实现双光子吸收的同时还具有化学惰性、低毒性、易于功能化等特点，已被广泛应用于生物成像、光催化以及荧光传感等领域。然而，已报道的石墨烯量子点存在双光子吸收截面小、荧光量子产率低以及发射光谱范围窄等问题，在生物成像领域中的应用受到了很大的限制；在实际应用中需要采取高强度激光激发高浓度荧光探针的方法来获取较强的信号，从而限制了其在生物医学成像中的进一步应用。此外，现有的石墨烯量子点荧光纳米探针多数是一对一的信号转换模式，灵敏度不高。因此，探索一种“一对多”的提高信号传导部位转换效率的技术，能够增强双光子探针的吸收截面和光学信号响应灵敏度，对于复杂体系中靶标的检测和成像分析，以及癌症的早期诊断极具价值。
[0004]信号放大技术是近年来发展的一种利用核酸工具酶和核酸体外扩增、功能化材料等手段，结合光学（如荧光、比色、拉曼）和电化学等检测手段建立起来的高灵敏检测方法。纳米材料由于具有独特的光学、电学效应以及高比表面积等优良特性，是绝佳的用于信号放大的材料，由此发展了基于功能纳米材料的信号放大技术。其中，二氧化硅纳米粒子（SiO2）作为一种常用的纳米基质材料，具有生物学相容性好、易官能化、无毒、尺寸可控及结构稳定等优势，已被用于原位法制备复合荧光纳米探针的构建中。但是所制得的复合硅球的性状不统一、粒径不均匀，且荧光量子产率不高，限制了其高灵敏、实时成像检测应用。
[0005]通常的双光子石墨烯量子点纳米探针多数双光子吸收截面小、荧光量子产率低、以及一对一信号转换模式的灵敏度低，本专利技术将功能化纳米材料信号放大技术引入到荧光探针的信号识别转导过程中，构建出“一对多”的信号转导模式。若将功能纳米材料信号放大策略与双光子成像技术进行创新结合，并引入特异性识别元件，在高效靶向识别和高灵敏成像检测方面具有较大的发展前景和研究价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法及应用，该方法采用分步骤、表面修饰法制备二氧化硅@石墨烯量子点（SiO2@GQDs）复合纳米颗粒，不仅操作简便、易纯化分离，而且二氧化硅作为功能纳米信号放大载体的存在，提供了“一对多”的信号转导模式，用于对靶细胞的特异性识别和高灵敏实时成像检测。
[0007]本专利技术为实现上述目的采用如下技术方案，一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：所述基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针由石墨烯量子点、二氧化硅纳米颗粒和适配体Sgc8c复合而成，其中石墨烯量子点作为双光子荧光信号单元，是以氧化石墨烯为碳源，利用N,N
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二甲基甲酰胺（DMF）溶剂热法制备所得；二氧化硅纳米颗粒作为功能纳米材料信号放大载体，是由反相微乳法制备所得，并通过共价键作用与石墨烯量子点结合制得二氧化硅@石墨烯量子点（SiO2@GQDs）复合纳米颗粒，再将CCRF
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CEM细胞特异性适配体Sgc8c交联接枝在二氧化硅@石墨烯量子点复合纳米颗粒表面制得靶向复合双光子纳米探针SiO2@GQDs
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Sgc8c。
[0008]本专利技术所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于具体步骤为：步骤S1：以氧化石墨烯为碳源，于150~250℃利用N,N
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二甲基甲酰胺溶剂热法合成发射绿色荧光的羧基化GQDs；步骤S2：利用反相微乳法合成氨基化二氧化硅纳米颗粒（NH2‑
SiO2），通过EDC
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NHS反应与羧基化GQDs表面的
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COOH共价偶联，形成SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒；步骤S3：将CCRF
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CEM细胞特异性适配体Sgc8c交联接枝在SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒表面，形成目标产物靶向复合双光子纳米探针SiO2@GQDs
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Sgc8c。
[0009]进一步限定，步骤S1的具体过程为：将氧化石墨烯粉末加至N,N
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二甲基甲酰胺中，超声并且搅拌溶解完全，将溶液转移至反应釜中，再置于烘箱中于200℃进行溶剂热反应4.5h，待反应结束后取出反应釜中的反应液冷却至20~30℃，然后将反应液过滤并收集滤液，装入透析袋，在超纯水中透析，透析后的产物经冷冻干燥后得到淡黄色的石墨烯量子点粉末。
[0010]进一步限定，步骤S1中所述氧化石墨烯与N,N
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二甲基甲酰胺的投料配比2mg:1mL，将氧化石墨烯加入到N,N
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二甲基甲酰胺中，在15~25℃、150W条件下超声处理30min，使其混合均匀并完全溶解。
[0011]进一步限定，步骤S1中所述过滤过程使用孔径为0.22μM的微孔滤膜过滤除去氧化石墨烯残渣，所述透析过程是将滤液在8000Da的透析袋中透析24h，所述冷冻干燥温度为
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50~
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40℃，真空度为9~10Pa，冷冻干燥时间为12h。
[0012]进一步限定，步骤S2的具体过程为：以环己烷、正己醇、曲拉通X
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100和水组成反相微乳液体系，以APTES为氨基硅烷化试剂，反应制得NH2‑
SiO2纳米颗粒分散液；将步骤S1得到的石墨烯量子点分散在PBS缓冲溶液中，再加入缩合剂进行活化，其中缩合剂为N
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羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo
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NHS）和1
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乙基
‑3‑
(3
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二甲胺丙基)碳二亚胺（EDC）的混合物，混匀超声分散5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：所述基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针由石墨烯量子点、二氧化硅纳米颗粒和适配体Sgc8c复合而成，其中石墨烯量子点作为双光子荧光信号单元，是以氧化石墨烯为碳源，利用N,N
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二甲基甲酰胺溶剂热法制备所得；二氧化硅纳米颗粒作为功能纳米材料信号放大载体，是由反相微乳法制备所得，并通过共价键作用与石墨烯量子点结合制得二氧化硅@石墨烯量子点复合纳米颗粒，再将CCRF
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CEM细胞特异性适配体Sgc8c交联接枝在二氧化硅@石墨烯量子点复合纳米颗粒表面制得靶向复合双光子纳米探针SiO2@GQDs
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Sgc8c。2.根据权利要求1所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于具体步骤为：步骤S1：以氧化石墨烯为碳源，于150~250℃利用N,N
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二甲基甲酰胺溶剂热法合成发射绿色荧光的羧基化GQDs；步骤S2：利用反相微乳法合成氨基化二氧化硅纳米颗粒，通过EDC
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NHS反应与羧基化GQDs表面的
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COOH共价偶联，形成SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒；步骤S3：将CCRF
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CEM细胞特异性适配体Sgc8c交联接枝在SiO2@GQDs复合荧光纳米颗粒表面，形成目标产物靶向复合双光子纳米探针SiO2@GQDs
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Sgc8c。3.根据权利要求2所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：步骤S1的具体过程为：将氧化石墨烯粉末加至N,N
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二甲基甲酰胺中，超声并且搅拌溶解完全，将溶液转移至反应釜中，再置于烘箱中于200℃进行溶剂热反应4.5h，待反应结束后取出反应釜中的反应液冷却至20~30℃，然后将反应液过滤并收集滤液，装入透析袋，在超纯水中透析，透析后的产物经冷冻干燥后得到淡黄色的石墨烯量子点粉末。4.根据权利要求2所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述氧化石墨烯与N,N
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二甲基甲酰胺的投料配比2mg:1mL，将氧化石墨烯加入到N,N
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二甲基甲酰胺中，在15~25℃、150W条件下超声处理30min，使其混合均匀并完全溶解。5.根据权利要求2所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：步骤S1中所述过滤过程使用孔径为0.22μM的微孔滤膜过滤除去氧化石墨烯残渣，所述透析过程是将滤液在8000Da的透析袋中透析24h，所述冷冻干燥温度为
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50~
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40℃，真空度为9~10Pa，冷冻干燥时间为12h。6.根据权利要求2所述的基于适配体修饰二氧化硅@石墨烯量子点的双光子信号放大探针的制备方法，其特征在于：步骤S2的具体过程为：以环己烷、正己醇、曲拉通X
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100和水组成反相微乳液体系，以APTES为氨基硅烷化试剂，反应制得NH2‑
SiO2纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫慧娟，谢凯，贺新禹，范亚桢，任武，高一乔，刘双慧，吕洁丽，赵营，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：