表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术本发明专利技术属于基因工程疫苗技术领域，具体涉及表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒及其构建方法和应用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将含优化的新城疫基因VII型株的F基因与SV40融合表达盒插入HVT US2病毒非复制区。本发明专利技术获得的重组病毒rHVT

【技术实现步骤摘要】
表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程疫苗
，具体涉及表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]新城疫病毒(Newcastle disease virus)，主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株感染后致死率可达100％。鸡新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种急性且高度传染性的疾病，给世界养禽业造成巨大的经济损失。目前普遍认为NDV只有一个血清型，但有多个基因型，我国流行株为NDV基因
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型。随着养禽业的迅猛发展，我国对ND的防控愈加重视，接种疫苗是NDV防控最有效的手段之一。活疫苗和灭活疫苗作为多年来防控NDV的传统疫苗，有效地控制了ND的传播和发病，但是传统疫苗在免疫原性、安全性和稳定性等方面都存在着一定的不足，因此开发更加安全有效的新型疫苗是我们目前的研究重点。
[0003]火鸡疱疹病毒(Turkey herpesvirus，HVT)重组活载体疫苗是把保护性抗原的基因序列重组到载体病毒基因组的特定位置中，获得能够表达外源基因的重组病毒。HVT属于马立克病毒(Marek
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s disease virus，MDV)血清3型，对鸡无致瘤性，具有良好的安全性，而且HVT基因组大，含有多个复制非必须区，可供多个外源基因插入。除此之外，以HVT为载体的疫苗还能免疫1日龄雏鸡，避免母源抗体干扰的同时可以产生持久免疫。产生重组HVT的策略主要包括常规同源重组、BAC(细菌人工染色体)系统、Fosmid/Cosmid粘粒系统、CRISPR/Cas9基因编辑系统，其中前两种方法编辑效率低、制作过程耗时费力，已经逐渐不被选择。CRISPR/Cas9基因编辑系统由于其成本低、效率高和操作简便成为目前最常用的高效基因编辑工具之一。天然的CRISPR/Cas9系统包括Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA，为方便实验设计以及提高gRNA的稳定性，人为地将crRNA和tracrRNA改造为sgRNA，极大地提高了CRISPR/Cas9的编辑效率。目前CRISPR/Cas9系统已被应用于基因功能筛选、为诊断和基因治疗创建细胞和动物模型、抗菌和抗病毒药物研究以及疫苗研发等广泛领域。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒及其构建方法和应用，所述重组火鸡疱疹病毒可以作为疫苗提供良好的保护作用。
[0005]本专利技术提供的技术方案如下：
[0006]表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒，将NDV Fopt基因表达盒插入HVT病毒复制非必需US2区，位置为140,065nt
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140,913nt之间。
[0007]进一步的，所述鸡新城疫病毒F基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
[0008]进一步的，所述NDV Fopt基因表达盒的序列如SEQ ID NO:5所示。
[0009]进一步的，所述NDV Fopt基因表达盒由SV40启动子、优化的F基因和BGH poly A及
终止子依次连接而成；所述SV40启动子核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述BGH poly A核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]本专利技术还提供一种转移载体质粒，所述转移载体质粒携带eGFP筛选基因和由SV40序列控制下的NDV Fopt基因表达盒。
[0011]本专利技术还提供表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，针对HVT US2靶位点设计和合成sgRNA序列，构建CRISPR/Cas9质粒pX459
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HVT US2
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sgRNA；构建带有eGFP筛选基因及由SV40序列控制下的NDV Fopt基因表达盒的转移载体pT
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sgA
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eGFP
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SV40
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Fopt，通过共转染CRISPR/Cas9质粒与转移载体质粒，感染病毒后，筛选纯化得到重组火鸡疱疹病毒rHVT
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eGFP
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Fopt，之后通过转染Cre真核表达质粒，感染rHVT
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eGFP
‑
Fopt，筛选纯化得到表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒rHVT
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Fopt。
[0012]进一步的，在插入位点HVT US2区设计靶位点sgRNA，其序列为SEQ ID NO:4。
[0013]进一步的，所述sgRNA序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
[0014]进一步的，所述转移载体pT
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sgA
‑
eGFP
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SV40
‑
Fopt的引物如SEQ ID NO:8～13所示。
[0015]本专利技术还提供上述表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒在制备鸡新城疫病毒疫苗中的应用。
[0016]所述NDV F基因，其裂解位点已更换为鸡新城疫活疫苗(LaSota株)的裂解位点，并且根据鸡的密码子亲嗜性进行密码子优化，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
[0017]一种重组火鸡疱疹病毒，在插入位点HVT US2区设计高效向导sgRNA
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HVT US2
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sgRNA，其序列为SEQ ID NO:4。
[0018]一种构建重组火鸡疱疹病毒的方法，使用CRISPR/Cas9技术将SV40序列控制下优化的NDV F基因表达盒插入HVT复制非必需区US2中，经过筛选纯化及鉴定得到所述的重组火鸡疱疹病毒。
[0019]所述重组火鸡疱疹病毒作为疫苗免疫鸡能够诱导机体产生100％的免疫保护率。
[0020]本专利技术提供一种基于CRISPR/Cas9靶向HVT基因组US2区的sgRNA向导序列。
[0021]本专利技术提供一个由SV40(猿猴病毒40启动子)序列控制下的NDV F基因表达盒，其中F基因根据鸡的密码子亲嗜性进行密码子优化，命名为NDV Fopt，该表达盒的基因序列如Seq ID No:5所示。
[0022]本专利技术提供一个带有eGFP筛选基因及由SV40序列控制下的NDV Fopt基因表达盒的转移载体质粒。
[0023]本专利技术提供一种表达NDV F基因的重组火鸡疱疹病毒的构建方法。具体方法包括：
[0024]1.本专利技术针对HVT US2靶位点设计和合成sgRNA序列，构建CRISPR/Cas9质粒pX459
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HVT US2
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sgRNA。
[0025]2.本专利技术设计优化的NDV基因VII型F基因，构建带有eGFP筛选基因及由SV40序列控制下的ND本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，将NDV Fopt基因表达盒插入HVT病毒复制非必需US2区，位置为140,065nt
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140,913nt之间。2.根据权利要求1所述的表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述鸡新城疫病毒F基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。3.根据权利要求1所述的表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述NDV Fopt基因表达盒的序列如SEQ ID NO:5所示。4.根据权利要求1所述的表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述NDV Fopt基因表达盒由SV40启动子、优化的F基因和BGH poly A及终止子依次连接而成；所述SV40启动子核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述BGH poly A核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。5.一种转移载体质粒，其特征在于，所述转移载体质粒携带eGFP筛选基因和由SV40序列控制下的NDV Fopt基因表达盒。6.根据权利要求1～4任一项所述的表达鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒的构建方法，其特征在于，针对HVT US2靶位点设计和合成sgRNA序列，构建CRISPR/Cas9质粒pX459
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HVT US2
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sgRNA；构建带有eGFP筛选基因及由SV40序列控制下的NDV Fopt基因表达盒的转移载体pT
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【专利技术属性】
技术研发人员：钱琨，申可，石彬，秦爱建，邵红霞，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：