固定化自组装蛋白质多聚体制造技术

本公开提供了用于固定多聚体多肽的表面和方法，该固定保留了天然多聚体多肽的功能和活性构象。该多聚体多肽是一种自组装多聚体，并且包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者。并且包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者。并且包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】固定化自组装蛋白质多聚体


[0001]本公开涉及具有固定在其上的多肽多聚体如多肽异源二聚体并维持该异源二聚体的生物活性的表面。

技术介绍

[0002]固定化蛋白质是蛋白质组学及诊断中的重要工具，可以让人们获得关于蛋白质功能和相互作用的信息。固定化蛋白质和酶对于商业用途非常重要，因为它们对相关反应的费用和过程具有许多好处，包括使用的方便性，可重复使用性，以及与可溶形式的蛋白质和酶相比更大的稳定性。理想情况下，蛋白质需要固定到表面上，同时维持它们的生物活性，并且可选地具有高密度以便允许使用少量的样品溶液。为了改进检测性能，还需要避免或至少最小化非特异性蛋白质吸附。

技术实现思路

[0003]本公开使用带电尾部在表面上提供生物活性形式的多聚体(如异源二聚体)。该带电尾部将多聚体固定到表面上，同时仍允许多聚体的单体蛋白质单元彼此相互作用。带电尾部也彼此相互作用。
[0004]根据一个方面，提供了具有第一羟基基团和第二羟基基团以及固定在其上的至少一种自组装多聚体的表面，其中：该至少一种自组装多聚体包含与第二嵌合多肽缔合的至少一个第一嵌合多肽。第一嵌合多肽具有式(Ia)或(Ib)，第二嵌合多肽具有式(IIa)或(IIb)：
[0005]NH2–
FPM
–
FAAL
–
AAT
–
COOH
ꢀꢀ
(Ia)
[0006]NH2–
AAT
–
FAAL
–
FPM
–/>COOH
ꢀꢀ
(Ib)
[0007]式中FPM是第一多肽部分；FAAL是任选的第一氨基酸接头；AAT是具有至少三个酸性氨基酸残基的酸性氨基酸尾部，该至少三个酸性氨基酸残基各自具有包含羧基基团的R基团，并且其中AAT具有约3至约5的pI；并且
–
是胺键。第二嵌合多肽具有式(IIa)或(IIb)：
[0008]NH2–
SPM
–
SAAL
–
BAT
–
COOH
ꢀꢀ
(IIa)
[0009]NH2–
BAT
–
SAAL
–
SPM
–
COOH
ꢀꢀ
(IIb)
[0010]式中SPM是第二多肽部分；SAAL是任选的第二氨基酸接头；BAT是具有至少一个酸性氨基酸残基的碱性氨基酸尾部，该至少一个酸性氨基酸残基具有包含羧基基团的R基团，并且其中BAT具有约9至11的pI；并且
–
是胺键。第一嵌合多肽的羧基基团共价缔合至第一硅烷接头(FSL)部分，其中FSL与表面的第一羟基基团共价缔合。第二嵌合多肽的羧基基团共价缔合至第二硅烷接头(SSL)部分，其中SSL与表面的第二羟基基团共价缔合。AAT与BAT非共价缔合。第一嵌合多肽与第二多肽部分非共价缔合。在一些实施方案中，FPM和SPM相同，并且多聚体是同源二聚体、同源三聚体或包含多于三个相同多肽部分的同源多聚体。在附加的实施方案中，FPM和SPM不同，并且多聚体是异源二聚体、异源三聚体或包含附加的多肽部分的异源多聚体。在一个实施方案中，AAT的长度为至少3个且至多50个氨基酸残基。在进
一步的实施方案中，其中AAT具有约4的pI。在又一实施方案中，其中AAT具有约3.91的pI。在一些实施方案中，AAT具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或者其功能变体或片段。在一个实施方案中，BAT的长度为至少1个且至多50个氨基酸残基。在进一步的实施方案中，BAT具有约的pI。在又进一步的实施方案中，BAT具有约10.1的pI。在再一个实施方案中，BAT具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列或者其功能变体或片段。在又一实施方案中，第一嵌合多肽具有FAAL和/或第二嵌合多肽具有SAAL。在一个实施方案中，该至少一种自组装多聚体包含表面蛋白的胞外结构域。在再一个实施方案中，该至少一种自组装多聚体中的一种或多种是活化的表面蛋白。在再一个实施方案中，该至少一种自组装多聚体是整联蛋白二聚体。在另一实施方案中，第一嵌合多肽包含αllb多肽，并且第二嵌合多肽包含β3多肽。在这样的实施方案中，FPM具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者其功能变体或片段和/或SPM具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或者其功能变体或片段。在一个实施方案中，表面是球形表面，如微球(例如，微球二氧化硅珠粒)。在再一个实施方案中，表面包含平面表面。在一些实施方案中，FSL和/或SSL包含与AAT或BAT的羧基基团共价缔合的一个或多个胺基团或硫醇基团。在更进一步的实施方案中，FSL和/或SSL部分包含(3
‑
三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺(DETA)。在具体实施方案中，表面包含式(Ia)的第一嵌合多肽和式(IIa)的第二嵌合多肽；式(Ib)的第一嵌合多肽和式(IIa)的第二嵌合多肽；式(Ia)的第一嵌合多肽和式(IIb)的第二嵌合多肽；或式(Ib)的第一嵌合多肽和式(IIb)的第二嵌合多肽。
[0011]根据另一方面，提供了将至少一种自组装多聚体固定到具有与第一硅烷接头部分和第二硅烷接头部分共价缔合的第一羟基基团和第二羟基基团的表面的方法。该至少一种自组装多聚体包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽。该方法包括获得如本文所述的第一嵌合多肽；获得如本文所述的第二嵌合多肽；以及在合适的条件下将第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在溶剂中添加到表面，以使第一嵌合多肽和第二嵌合多肽经由硅烷接头部分共价键合至表面。第一嵌合多肽的AAT与第二嵌合多肽的BAT非共价缔合，并且第一多肽部分与第二多肽部分非共价缔合。根据权利要求24所述的方法，其中第一硅烷接头部分和第二硅烷接头部分包含与AAT或BAT的羧基基团共价缔合的一个或多个胺基团或硫醇基团。在一个实施方案中，第一硅烷接头部分和/或第二硅烷接头部分包含(3
‑
三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺(DETA)。在另一实施方案中，该方法进一步包括通过与羟基基团反应来用硅烷接头部分包被表面。在再一个实施方案中，该方法进一步包括从重组宿主细胞中的重组表达获得第一嵌合多肽和第二嵌合多肽。在再一个实施方案中，该方法进一步包括活化至少一种自组装多聚体。在这样的实施方案中，该方法包括在包含阳离子的活化缓冲液中孵育其上键合有第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的表面。在一些实施方案中，活化缓冲液包含二价阳离子。在进一步的实施方案中，至少一种自组装多聚体包含表面蛋白的胞外结构域。在一个实施方案中，该至少一种自组装多聚体是整联蛋白二聚体。在再一个实施方案中，表面是微球或者是平坦的。
[0012]根据另一方面，提供了试剂盒，该试剂盒包含如本文所述的(i)第一嵌合多肽和(ii)第二嵌合多肽，其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽能够形成多聚体，以及任选的(iii)用于共价缔合第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的表面，其中该表面具有与第一硅烷接头部分和第二硅烷接头部分共价缔合的羟基基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种具有第一羟基基团和第二羟基基团以及固定在其上的至少一种自组装多聚体的表面，其中：
‑
所述至少一种自组装多聚体包含与第二嵌合多肽缔合的第一嵌合多肽中的至少一个，
‑
所述第一嵌合多肽具有式(Ia)或(Ib)：NH2–
FPM
–
FAAL
–
AAT
–
COOH
ꢀꢀꢀꢀ
(Ia)NH2–
AAT
–
FAAL
–
FPM
–
COOH
ꢀꢀꢀꢀ
(Ib)式中FPM是第一多肽部分；FAAL是任选的第一氨基酸接头；AAT是具有至少三个酸性氨基酸残基的酸性氨基酸尾部，所述至少三个酸性氨基酸残基各自具有包含羧基基团的R基团，并且其中所述AAT具有约3至约5的pI；并且
–
是胺键；
‑
所述第二嵌合多肽具有式(IIa)或(IIb)：NH2–
SPM
–
SAAL
–
BAT
–
COOH
ꢀꢀꢀꢀ
(IIa)NH2–
BAT
–
SAAL
–
SPM
–
COOH
ꢀꢀꢀꢀ
(IIb)式中SPM是第二多肽部分；SAAL是任选的第二氨基酸接头；BAT是具有至少一个酸性氨基酸残基的碱性氨基酸尾部，所述至少一个酸性氨基酸残基具有包含羧基基团的R基团，并且其中所述BAT具有约9至约11的pI；并且
–
是胺键；
‑
所述第一嵌合多肽的羧基基团共价缔合至第一硅烷接头(FSL)部分，其中所述FSL与所述表面的第一羟基基团共价缔合；
‑
所述第二嵌合多肽的羧基基团共价缔合至第二硅烷接头(SSL)部分，其中所述SSL与所述表面的第二羟基基团共价缔合；
‑
所述AAT与所述BAT非共价缔合；并且
‑
所述第一嵌合多肽与所述第二多肽部分非共价缔合。2.根据权利要求1所述的表面，其中所述AAT的长度为至少3个且至多50个氨基酸残基。3.根据权利要求1或2所述的表面，其中所述AAT具有约4的pI。4.根据权利要求3所述的表面，其中所述AAT具有约3.91的pI。5.根据权利要求4所述的表面，其中所述AAT具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或者其功能变体或片段。6.根据权利要求1至5中任一项所述的表面，其中所述BAT的长度为至少1个且至多50个氨基酸残基。7.根据权利要求1至6中任一项所述的表面，其中所述BAT具有约的pI。8.根据权利要求7所述的表面，其中所述BAT具有约10.1的pI。9.根据权利要求8所述的表面，其中所述BAT具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列或者其功能变体或片段。10.根据权利要求1至9中任一项所述的表面，
‑
其中所述第一嵌合多肽具有所述FAAL；和/或
‑
其中所述第二嵌合多肽具有所述SAAL。11.根据权利要求1至10中任一项所述的表面，其中所述至少一种自组装多聚体包含表面蛋白的胞外结构域。12.根据权利要求11所述的表面，其中所述至少一种自组装多聚体中的一种或多种是活化的表面蛋白。13.根据权利要求11或12所述的表面，其中所述至少一种自组装多聚体是整联蛋白二聚体。14.根据权利要求13所述的表面，其中所述第一嵌合多肽包含αllb多肽，并且所述第二嵌合多肽包含β3多肽。15.根据权利要求14所述的表面，其中所述FPM具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或者其功能变体或片段。16.根据权利要求14或15所述的表面，其中所述SPM具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列或者其功能变体或片段。17.根据权利要求1至16中任一项所述的表面，其中所述表面是球形表面。18.根据权利要求17所述的表面，其中所述表面是微球。19.根据权利要求18所述的表面，其中所述表面是微球二氧化硅珠粒。20.根据权利要求1至19中任一项所述的表面，其中所述表面包含平面表面。21.根据权利要求1至20中任一项所述的表面，其中所述FSL和/或SSL包含与所述AAT或所述BAT的羧基基团共价缔合的一个...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪合宇，米格尔，
申请(专利权)人：西西欧艾杭州生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：