一种Cas12a专用型免疫层析试纸条及其制备方法以及应用技术

本发明专利技术提供一种Cas12a专用型免疫层析试纸条及其制备方法以及应用，该方法包括步骤：S1：将样品垫和结合垫经不同处理液浸透后干燥；S2：在层析膜上进行检测T线和质控C线的划线，划线条件分别为含0.2％BSA的1mg/mL的羊抗兔二抗和2mg/mL的r

【技术实现步骤摘要】
一种Cas12a专用型免疫层析试纸条及其制备方法以及应用


[0001]本专利技术涉及分子检测
，更具体地涉及一种Cas12a专用型免疫层析试纸条及其制备方法以及应用。

技术介绍

[0002]侧流层析技术(lateral flow chromatographic assay,LFCA)是一种基于免疫识别或者核酸杂交以及抗体标记技术，使待检测物中各组分(抗原、抗体、蛋白质、核酸等)通过毛细管作用力的移动速度差异，在反应基质上实现分离，用来检测样品中目标物质的有效技术。该技术具有操作简单、检测成本低、检测效率高等优点，且因无需设备被广泛应用于各种现场检测领域。通过与等温扩增技术相结合，基于CRISPR系统的高灵敏试纸条方法已被开发，彻底打破了试纸条方法在灵敏度方面的局限性。
[0003]Tsou等(2019)将CRISPR/Cas12a与侧流试纸条相结合，直接特异性检测液体样品中的HPV16和HPV18，检出限可达0.24fM，与聚合酶链式反应相同，但所需时间更短。基于环介导等温扩增(LAMP)、CRISPR/Cas12a“反式切割”和侧流生物传感器(LFB)的结合，一种超灵敏的HPV16和HPV18检测方法(命名为CIALFB)被开发，该方法实现了对3.1aM(约1.8个拷贝)靶标的高灵敏检测，对临床样本具有可靠的特异性。Zhu等(2022)开发了一种无需PAM依赖的环介导的等温扩增(LAMP)辅助的CRISPR/Cas12a检测平台(命名为Cas
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PfLAMP)，该系统可用于快速(约50分钟)、准确地检测三种水稻病原体，灵敏度低至9或3个拷贝。这些应用证明了CRISPR检测试纸条的高效性与高灵敏性，也为转基因快速检测提供了新思路。
[0004]然而，目前大多CRISPR试纸条相关研究中均使用基于核酸的通用型商业化试纸条，由于通用型试纸条与所优化的CRISPR反应体系之间匹配性不佳，导致试纸条检测效果不佳。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种Cas12a专用型免疫层析试纸条及其制备方法以及应用，从而解决现有技术中CRISPR检测试纸条检测效果不佳的问题。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]根据本专利技术的第一方面，提供一种Cas12a专用型免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：S1：样品垫和结合垫的预处理：将样品垫和结合垫经不同处理液浸透后干燥待用，其中，样品垫处理液为：2％葡萄糖、1％Triton X
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100、1％BSA、50mM硼酸，pH 8.0，结合垫处理液的成分为：1％蔗糖、3％BSA、0.5％Tween
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20，溶剂为0.01M Tris
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base溶液，pH 8.0；S2：检测线T和质控线C的划线：使用胶体金点样系统在层析膜上进行检测线T和质控线C的划线，检测线T的划线条件为含0.2％BSA的1mg/mL的羊抗兔二抗，质控线C的划线条件为2mg/mL的r
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SA；S3：组装：依次将完成划线的层析膜、结合垫、样品垫、吸收垫组装于粘性底板上，相邻两者间部分重叠，其中，样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫沿层析方向依次排列，质控线C靠近结合垫，检测线T靠近吸收垫；S4：剪切：将组装完成后的复合板剪切制成规定
宽度的免疫层析试纸条，于干燥条件下密封保存待用。
[0008]优选地，选择CN140为层析膜。
[0009]优选地，在经过预处理后的结合垫上进一步施加4μL胶体金标记FITC抗体，含0.8μg FITC抗体。
[0010]优选地，步骤S4中，复合板通过剪切制成3mm宽的免疫层析试纸条。
[0011]根据本专利技术的第二方面，提供一种根据上述制备方法制备得到的Cas12a专用型免疫层析试纸条。
[0012]根据本专利技术的第三方面，提供一种Cas12a专用型免疫层析试纸条在转基因作物检测中的应用，包括以下步骤：1)对待检测样品进行基因组DNA提取；2)RPA扩增：以所述基因组DNA为模板，以P
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CaMV 35S和T
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NOS为靶标，分别使用与P
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CaMV 35S和T
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NOS对应的RPA引物进行RPA扩增反应；3)Cas12a酶切反应：对步骤2)获得的RPA扩增产物进行Cas12a酶切，反应条件为37℃，15min；4)免疫层析试纸条检测：将步骤3)获得的Cas12a酶切产物滴加至所制备的免疫层析试纸条的样品垫处，将所述样品垫的一端浸入层析缓冲液中，竖直静置3～7min，待缓冲液到达吸收纸后将所述免疫层析试纸条取出，观察C线、T线显色情况；当所述免疫层析试纸条同时显出清晰的检测线T和质控线C，表示靶标P
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CaMV 35S和/或T
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NOS存在；当所述免疫层析试纸条仅显出一条清晰的质控线C，表示靶标P
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CaMV 35S和T
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NOS均不存在；当所述免疫层析试纸条上的检测线T和质控线C均不显现，表示检测失败或试纸条失效。
[0013]步骤2)中，与所述靶标P
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CaMV 35S和T
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NOS对应的RPA引物为：
[0014]用于检测P
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CaMV 35S基因的引物对：RPA
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35S
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F：5'
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CCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACC
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3'，RPA
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35S
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R：5'
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CCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCC
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3'；
[0015]用于检测T
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NOS基因的引物对：RPA
‑
NOS
‑
F：5'
‑
TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC
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3'，RPA
‑
NOS
‑
R：5'
‑
TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC
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3'。
[0016]步骤2)中，所述RPA扩增反应的扩增体系包括：29.5μL Primer free rehydration buffer，上下游引物(10μM)各2.4μL，ddH2O 11.2μL，2.5μL MgOAC，2μLDNA模板。
[0017]步骤3)中，Cas12a酶切反应体系中使用15n
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Biotin
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ssDNA探针，其使用终浓度为250nM。
[0018]步骤4)中，所使用的层析缓冲液的成分为：25mM Tris、150mM NaCl、0.05％Tween
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20、5％PEG 6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas12a专用型免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：样品垫和结合垫的预处理：将样品垫和结合垫经不同处理液浸透后干燥待用，其中，样品垫处理液为：2％葡萄糖、1％Triton X
‑
100、1％BSA、50mM硼酸，pH 8.0，结合垫处理液为：1％蔗糖、3％BSA、0.5％Tween
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20，溶剂为0.01M Tris
‑
base溶液，pH 8.0；S2：检测线T和质控线C的划线：使用胶体金点样系统在层析膜上进行检测线T和质控线C的划线，检测线T的划线条件为含0.2％BSA的1mg/mL的羊抗兔二抗，质控线C的划线条件为2mg/mL的r
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SA；S3：组装：依次将完成划线的层析膜、结合垫、样品垫、吸收垫组装于粘性底板上，相邻两者间部分重叠，其中，样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫沿层析方向依次排列，质控线C靠近结合垫，检测线T靠近吸收垫；S4：剪切：将组装完成后的复合板剪切制成规定宽度的免疫层析试纸条，于干燥条件下密封保存待用。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，选择CN140为层析膜。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括在经过处理液预处理后的结合垫上进一步施加4μL胶体金标记FITC抗体，含0.8μg FITC抗体。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，复合板通过剪切制成3mm宽的免疫层析试纸条。5.一种根据权利要求1～4中任意一项所述的制备方法制备得到的Cas12a专用型免疫层析试纸条。6.一种根据权利要求5所述的Cas12a专用型免疫层析试纸条在转基因作物检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)对待检测样品进行基因组DNA提取；2)RPA扩增：以所述基因组DNA为模板，以P
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CaMV 35S和T
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NOS为靶标，分别使用与P
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CaMV 35S和T
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NOS对应的RPA引物进行RPA扩增反应；3)Cas12a酶切反应：对步骤2)获得的RPA扩增产物进行Cas12a酶切，反应条件为37℃，15min；4)免疫层析试纸条检测：将步骤3)获得的Cas12a酶切产物滴加至所制备的免疫层析试纸条的样品垫处，将所述样品垫的一端浸入层析缓冲液中，竖直静置3～7min，待缓冲液到达吸收纸后将所述免疫层析试纸条取出，观察C线、T线显色情况；当所述免疫层析试纸条同时显出清晰的检测线T和质控...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金斌，刘华，曾海娟，王宇，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：