一种苹果酸转运蛋白突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种苹果酸转运蛋白突变体、表达该突变体的基因工程菌及其应用。表达该突变体的基因工程菌及其应用。表达该突变体的基因工程菌及其应用。

【技术实现步骤摘要】
一种苹果酸转运蛋白突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种苹果酸转运蛋白突变体及其应用。

技术介绍

[0002]有机酸，生物体的天然代谢产物，可转化为多种有价值的产品，如食品、药品、化妆品、洗涤剂、聚合物和纺织物。其中，L
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苹果酸作为微生物代谢的中间体、新一代的酸味剂和增味剂更是被广泛应用于食品和饮料行业。近年来，随着微生物改造技术的不断发展与进步，人们越来越多地使用微生物发酵法生产L
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苹果酸。
[0003]在微生物发酵法生产L
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苹果酸的过程中，因其产物中包括羧基(
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COOH)基团，因此极易形成低pH，这使得细胞代谢活性和生产效率受到严重抑制。目前，解决此类关键问题的主要策略是添加中和剂(碳酸钙CaCO3、碳酸镁MgCO3、氢氧化钠NaOH或氨水NH3·
H2O等等)，其形成的产物以苹果酸盐的形式存在。随后，苹果酸盐在HCl或H2SO4酸解的前提下进行纯化，以获得更高纯度的L
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苹果酸，该酸解过程不仅使下游净化工艺复杂，而且容易造成环境污染。因此，微生物L
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苹果酸生产的潜力尚未完全实现，而其中间产品形成的低pH是工业规模生产的主要瓶颈。此外，L
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苹果酸合成效率低也是微生物发酵法生产L
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苹果酸亟待解决的问题。
[0004]另外，为进一步实现高产L
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苹果酸的细胞工厂，转运是另一关键因素。在已知报道中，具有苹果酸转运功能的蛋白主要包括两种：来源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的SpMAE1、来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的四碳酸转运蛋白C4T318。由于C4T318多用于霉菌，对多数四碳酸具有转运功能，在苹果酸的生产过程中可能会转运一些其它副产物的四碳酸，所以，在酵母的发酵过程多选择SpMAE1。但是，本专利技术的前期研究发现，过表达SpMAE1后，酵母细胞内L
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苹果酸的浓度仍然仅有11.2g/L左右。
[0005]第ZL202110494752.8号中国专利中构建了重组酿酒酵母工程菌CTPM1、CTPM2和CTPM3，也仍然存在L
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苹果酸发酵产量低的问题(在250ml摇瓶培养下L
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苹果酸的产量分别为3.9g/L、8.6g/L和16.5g/L)。
[0006]因此，本领域中仍存在构建发酵生产L
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苹果酸时产量更高的重组耐酸酿酒酵母工程菌的需要。

技术实现思路

[0007]为了解决上述问题，在第一个方面，本专利技术的目的在于提供一种苹果酸转运蛋白突变体(SpMAE1
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F253A)，所述突变体具有突变位点F253A。
[0008]在具体的实施方案中，本专利技术的所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，更具体地，与所述突变体相对的突变前野生型苹果酸转运蛋白(SpMAE1)(来自粟酒裂殖酵母)，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]在第二个方面，本专利技术的目的在于提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达如
第一方面所述的苹果酸转运蛋白突变体。
[0010]在优选的实施方案中，本专利技术的所述基因工程菌中用组成型启动子表达所述苹果酸转运蛋白突变体。
[0011]在具体的实施方案中，本专利技术的所述基因工程菌中过表达L
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乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶中的一种或多种。在优选的实施方案中，本专利技术的所述基因工程菌中用组成型启动子表达所述L
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乳酸脱氢酶、所述丙酮酸激酶、所述苹果酸脱氢酶和所述丙酮酸羧化酶中的一种或多种。
[0012]在具体的实施方案中，本专利技术的所述基因工程菌中过表达两种或更多种丙酮酸羧化酶；在优选的实施方案中，所述基因工程菌中过表达氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的丙酮酸羧化酶1和氨基酸序列如SEQ ID No.4所示丙酮酸羧化酶2。
[0013]在具体的实施方案中，本专利技术的所述基因工程菌中过表达两种或更多种苹果酸脱氢酶；在优选的实施方案中，所述基因工程菌中过表达氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的苹果酸脱氢酶1和氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的苹果酸脱氢酶3。
[0014]在具体的实施方案中，本专利技术的所述基因工程菌中所述L
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乳酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示和/或所述丙酮酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0015]在具体的实施方案中，本专利技术的所述基因工程菌中敲低丙酮酸脱羧酶和/或乙醇脱氢酶的表达；在优选的实施方案中，所述丙酮酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示和/或所述乙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。
[0016]在具体的实施方案中，本专利技术的所述基因工程菌为酿酒酵母工程菌。在优选的实施方案中，所述酿酒酵母为耐酸酿酒酵母。
[0017]在第三个方面，本专利技术的目的在于提供如第一个方面中的苹果酸转运蛋白突变体、如第二个方面中的基因工程菌在发酵生产L
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苹果酸中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的上述技术方案具有以下优点：
[0019](1)与原始野生型苹果酸转运蛋白相比，本专利技术的苹果酸转运蛋白突变体可显著提高苹果酸转运体的转运效率，促进了L
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苹果酸的输出，从而提高发酵液上清中L
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苹果酸的产量。
[0020](2)本专利技术的基因工程菌还分别从提高关键前体丙酮酸的供应、弱化竞争性的乙醇合成竞争途径的代谢通量、引入异源合成途径等方面进行了改造，经过改造后的工程菌的L
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苹果酸产量均有明显提高，其中在不添加任何中和剂的前提下，本专利技术的酿酒酵母工程菌的L
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苹果酸产量最高可以达到202.1g/L，转化率为1.2mol/mol，生产强度为1.46g/L/h，并且在生产过程克服了产物低pH对细胞生产和代谢的抑制，在很大程度上实现了无中和剂的“绿色化生产”。
附图说明
[0021]图1是对工程菌菌株CTPM3和CTPM4进行PCR验证的结果。
[0022]图2是对本专利技术基因工程菌菌株CTPM5进行PCR验证的结果；其中图2A是对编码丙酮酸激酶的核苷酸序列进行PCR验证的结果，图2B是编码L
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乳酸脱氢酶的核苷酸序列进行PCR验证的结果。
[0023]图3是对本专利技术基因工程菌菌株CTPM6进行PCR验证的结果；其中图3A是对编码丙
酮酸脱羧酶的核苷酸序列进行PCR验证的结果，图3B是编码乙醇脱氢酶的核苷酸序列进行PCR验证的结果。
[0024]图4是对本专利技术基因工程菌菌株CTPM7进行PCR验证的结果。
[0025]图5是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种苹果酸转运蛋白突变体，其特征在于，所述突变体具有突变位点F253A，优选地，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达如权利要求1所述的苹果酸转运蛋白突变体；优选地所述基因工程菌中用组成型启动子表达所述苹果酸转运蛋白突变体。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中过表达L
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乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶中的一种或多种；优选地所述基因工程菌中用组成型启动子表达所述L
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乳酸脱氢酶、所述丙酮酸激酶、所述苹果酸脱氢酶和所述丙酮酸羧化酶中的一种或多种。4.根据权利要求3中所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中过表达两种或更多种丙酮酸羧化酶；优选地，所述基因工程菌中过表达氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的丙酮酸羧化酶1和氨基酸序列如SEQ ID No.4所示丙酮酸羧化酶2。5.根据权利要求3或4中所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中过表达两种或更多种苹果酸脱氢酶；优选地，所述基因工...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，张建国，陈坚，张天敏，吕雪芹，谢志鹏，刘延峰，孙利，陶荣哨，
申请(专利权)人：杭州宝晶生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：