一种异源表达的贻贝蛋白前体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种异源表达的贻贝蛋白前体及其应用，涉及基因工程、发酵工程与应用生物学领域，所述贻贝蛋白(Mfp2

【技术实现步骤摘要】
一种异源表达的贻贝蛋白前体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程、发酵工程与应用生物学领域，尤其是涉及一种异源表达的贻贝蛋白前体及其应用。

技术介绍

[0002]贻贝蛋白，作为一种源于自然界的天然粘性物质，具有优异的黏附性、柔韧性和良好的生物相容性，且毒性低，不会引发人体免疫反应等诸多优良性质。贻贝正是通过其足丝分泌的贻贝粘蛋白将自己固定在海水下的岩石、船体、缆绳、漂流瓶等固体表面上，形成抗水的结合，耐受风浪等的冲刷。通过对贻贝蛋白固化后形成的足丝的分离鉴定，当前得到四大类共11种蛋白质，分别是贻贝足丝蛋白：mfp
‑
1～6六种，胶原前体蛋白(Pre
‑
Collagen，Precol三种，一种足丝纤维近端基质蛋白(proximal matrix threadprotein,PMTP)以及多酚氧化酶(polyphenol oxidase enzyme)。
[0003]贻贝蛋白具有广阔的应用领域，然而贻贝蛋白的大规模生产仍是一个未解决的难题。在医学领域，贻贝蛋白可用于烧伤、激光术后等皮肤损伤的修复及眼角膜、结膜、细小骨骼等的粘接；作为生物涂层，使金属材料具有更好的生物相容性；日用化妆品领域，贻贝蛋白可以在皮肤表面形成微观的纳米级保护膜，在物理性阻隔、抗氧化、局部抗炎的作用下，治疗痤疮凹陷性瘢痕，迅速修复创面肌肤，抑制瘙痒及黑色素沉着，让肌肤远离PM2.5颗粒；防腐涂料领域，贻贝蛋白耐海水耐盐雾，可以保护金属及微电子设备。
[0004]目前贻贝蛋白的生产方式主要有三种手段：一、从贻贝足腺中提取纯化，获得单一蛋白质产品，也是目前生产贻贝蛋白产品的主要手段。但由于贻贝足丝蛋白的分泌量极低，10000个贻贝才能提取到1mg的贻贝足丝蛋白，生产成本高、提取效率低，导致这种直接提取的产品价格高达每毫克2000元以上；二、足腺细胞体外培养。但由于无脊椎动物细胞培养困难，其培养仍属世界性难题，贻贝足腺细胞的传代培养及其建系一直未能成功；三、基因工程。目前实现了利用大肠杆菌与酿酒酵母的重组表达，但由于基因工程途径无法进行严格且复杂的糖基化修饰，尽管可以体外进行糖基化修饰，重组蛋白性质远不及天然蛋白。因此，提出一种异源表达后体外转化的贻贝蛋白前体及其应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，针对目前生物转化生产方法获得贻贝蛋白价格高和产量低的问题，本专利技术提供一种异源表达的贻贝蛋白前体及其应用，通过采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕氏酵母(Pichia.pastoris)、大肠杆菌(Escherichia coli)作为基因工程出发菌株，经过基因工程改造的工程菌为发酵菌株，涉及的复合转化酶包括氧化酶和脱氢酶。工艺体系涉及水相/非水相催化体系。该两步法主要包括工程菌株的构建、贻贝蛋白前体发酵表达与发酵产物的酶法转化纯化。
[0006]本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：
[0007]一种异源表达的贻贝蛋白前体，所述贻贝蛋白前体具有如SEQ ID NO.1
‑
5任一所
示的氨基酸序列，所述贻贝蛋白前体异源表达的菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕氏酵母(Pichia.pastoris)、大肠杆菌(Escherichia coli)。
[0008]本专利技术还提供一种如上述异源表达的贻贝蛋白前体在制备贻贝蛋白中的应用。
[0009]进一步改进在于，制备贻贝蛋白，具体包括以下步骤：
[0010](1)根据贻贝蛋白前体表达菌株的密码子偏好性分别设计贻贝蛋白如SEQ ID NO.1
‑
5所示的贻贝蛋白前体氨基酸序列的编码基因序列，将基因序列连接至PET28a载体上并转入大肠杆菌DH5α中，经过筛选扩培，抽提质粒并进行双酶切验证、回收，获得目的序列，将目的序列连接到蛋白表达载体质粒上，转化受体菌，获得工程菌株；
[0011](2)将所述工程菌株经过活化和扩大化培养后进行发酵表达，发酵结束后，破碎菌体，使用亲和层析柱纯化发酵产物，获得纯化产物；
[0012](3)将所述纯化产物加入复合转化酶体系，进行酶转化，酶转化结束后，使用亲和层析柱，分离纯化转化产物，将纯化产物冷冻干燥，溶于1％柠檬酸溶液中，获得贻贝蛋白。
[0013]进一步改进在于，所述步骤(3)中的体系中的溶剂为水、乙酸乙酯、二甲亚砜、甘油中的一种。
[0014]进一步改进在于，所述步骤(3)中复合转化酶按照体系质量体积浓度的0.1
‰‑
20％添加到纯化产物中，酶法转化时间为0.4
‑
18h。
[0015]进一步改进在于，所述步骤(3)中复合转化酶包括氧化酶和脱氢酶。
[0016]进一步改进在于，所述氧化酶包括人体铜蓝蛋白、维生素C氧化酶、葡萄糖氧化酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、酪氨酸酶、漆酶、辣根过氧化物酶。
[0017]进一步改进在于，所述步骤(3)中体系的pH为3.5～8.5，温度为35～65℃。
[0018]进一步改进在于，所述步骤(2)纯化处理过程中流动相的流速为2.0
‑
3.0mL/s/kg。
[0019]本专利技术具有如下有益效果：
[0020]本专利技术方法与其他物理、化学和生物合成技术相比，贻贝蛋白更容易制备，且制备成本低，大规模应用更经济，且整个工艺过程中所添加的酶制剂及加工助剂安全无害。
附图说明
[0021]图1为本专利技术两步法生产贻贝蛋白技术路线图；
[0022]图2为氧化酶催化生成邻苯二酚的途径示意图；
[0023]图3为氧化酶催化苯酚邻位加成的自由基反应机制电子顺磁图谱；
[0024]图4为酶与底物及自由基中间体结合亲和力及键能三维结构对比图。
具体实施方式
[0025]下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
[0026]1、材料
[0027]本实验所用所有试剂如无特殊说明均为常规试剂，均使用去离子水配制，所使用到的仪器均为实验室常规仪器。
[0028]2、方法
[0029]2.1采用酿酒酵母作为基因工程出发菌株制备贻贝蛋白
[0030]2.1.1工程菌株的构建
[0031](1)基因序列扩增
[0032]根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)密码子偏好性设计氨基酸序列为SEQ ID NO.1的DNA目的序列(GenBank：AST36139.1)并合成。
[0033]以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为宿主，pPIC9k为克隆载体与表达载体设计引物，酶切位点选择AOXI启动子下游的EcoR1与Not1，合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异源表达的贻贝蛋白前体，其特征在于，所述贻贝蛋白前体具有如SEQ ID NO.1
‑
5任一所示的氨基酸序列，所述贻贝蛋白前体异源表达的菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕氏酵母(Pichia.pastoris)、大肠杆菌(Escherichia coli)。2.一种如权利要求1所述的异源表达的贻贝蛋白前体在制备贻贝蛋白中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，制备贻贝蛋白，具体包括以下步骤：(1)根据贻贝蛋白前体表达菌株的密码子偏好性分别设计如SEQ ID NO.1
‑
5所示的贻贝蛋白前体氨基酸序列的编码基因序列，将基因序列连接至PET28a载体上并转入大肠杆菌DH5α中，经过筛选扩培，抽提质粒并进行双酶切验证、回收，获得目的序列，将目的序列连接到蛋白表达载体上，转化受体菌，获得工程菌株；(2)将所述工程菌株经过活化和扩大化培养后进行发酵表达，发酵结束后，破碎菌体，使用亲和层析柱纯化发酵产物，获得纯化产物；(3)将所述纯化产物加入复合转化...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗学才，施昊，尹若春，
申请(专利权)人：安徽大学绿色产业创新研究院，
类型：发明
国别省市：