猪HAT1基因修饰系统及应用技术方案

本发明专利技术提供一种猪HAT1基因修饰系统及应用。本发明专利技术提供用于猪HATl基因修饰的系统，该系统中含有的第一载体、第二载体可以表达基因编辑工具蛋白和sgRNA，对HAT1基因的两个靶位点进行有效酶切，利用供体DNA的修饰片段替换为靶位的待修饰片段，实现HAT1基因精准修饰。为研究HAT1基因功能提供精准细胞和动物模型。为研究HAT1基因功能提供精准细胞和动物模型。

【技术实现步骤摘要】
猪HAT1基因修饰系统及应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑
，具体地说，涉及一种猪HAT1基因修饰系统及应用。

技术介绍

[0002]HAT1基因能够调控多种组蛋白和非组蛋白乙酰化，具有重要的表观遗传修饰调控功能，参与染色质重塑、基因转录激活、DNA复制及损伤修复、胚胎发育、核重编程等生物学过程。前期研究表明，HAT1基因表达量与猪克隆胚胎发育潜力密切相关，HAT1高表达的猪克隆胚胎的发育潜力更高。因此，构建HAT1基因修饰细胞或者动物模型对深入解析HAT1基因功能，促进猪克隆胚胎发育潜力具有重要意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种猪HAT1基因修饰系统及应用。
[0004]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种靶向猪HAT1基因的CRISPR/Cas载体，其sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和/或2所示。
[0005]优选地，其sgRNA作用位点的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1和2的组合。
[0006]其中，猪HAT1基因在GenBank上的登录号为100622317。
[0007]第二方面，本专利技术提供一种猪HAT1基因修饰系统，包含所述的CRISPR/Cas载体以及供体DNA。
[0008]其中，所述供体DNA含有猪HAT1基因第6外显子修饰片段，所述修饰片段编码的氨基酸序列包含猪HAT1蛋白第188位氨基酸由T到A的突变。
[0009]进一步地，所述CRISPR/Cas载体包含基因编辑蛋白表达盒和sgRNA表达盒。
[0010]所述基因编辑蛋白可选自Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2等，优选Cas9。
[0011]所述CRISPR/Cas载体的骨架载体可选自pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552等，优选pX458。
[0012]优选地，所述供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0013]第三方面，本专利技术提供所述猪HAT1基因修饰系统的以下任一应用：
[0014](a)构建HAT1基因修饰的细胞系；
[0015](b)构建HAT1基因修饰的猪模型。
[0016]第四方面，本专利技术提供猪HAT1基因修饰细胞的制备方法，包括向目的细胞中导入所述猪HAT1基因修饰系统，得到HAT1基因修饰的细胞。
[0017]优选地，所述目的细胞为猪成纤维细胞，更优选猪胎儿成纤维细胞；
[0018]优选地，导入的方法包括电穿孔法或脂质体转染法。
[0019]优选地，导入操作后通过筛选和鉴定，得到猪HAT1基因修饰的细胞。
[0020]优选地，所述筛选包括通过流式分选筛选单克隆细胞。
[0021]优选地，所述鉴定包括测序鉴定。
[0022]第五方面，本专利技术提供按照所述方法制备得到的猪HAT1基因修饰细胞。
[0023]第六方面，本专利技术提供HAT1基因修饰的基因编辑猪的制备方法，将所述猪HAT1基因修饰细胞移植入去核的猪卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母猪体内经妊娠，得到HAT1基因修饰的基因编辑猪。
[0024]优选地，基因编辑猪出生后还包括对基因编辑猪进行鉴定的步骤。
[0025]优选地，所述鉴定包括测序鉴定。
[0026]本专利技术的目的还可以采用以下技术措施来进一步实现。
[0027]本专利技术提供一种用于HAT1基因修饰的系统，含有第一载体、第二载体，以及供体DNA。
[0028]所述第一载体包括基因编辑蛋白表达盒和第一sgRNA(SEQ ID NO：1)表达盒。
[0029]所述第二载体包括基因编辑蛋白表达盒和第二sgRNA(SEQ ID NO：2)表达盒。
[0030]其中，第一sgRNA和第二sgRNA分别靶向HAT1基因的两个靶位点。
[0031]所述供体DNA含有HAT1基因第6外显子修饰片段，所述修饰片段用于替换HAT1基因待修饰片段。
[0032]所述HAT1基因修饰为将猪HAT1蛋白的188位苏氨酸(T)氨基酸替换为丙氨酸(A)。
[0033]进一步地，编码所述第一sgRNA为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
[0034]进一步地，编码所述第二sgRNA为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0035]进一步地，所述供体DNA为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
[0036]进一步地，所述基因编辑蛋白包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选为Cas9。
[0037]进一步地，所述第一载体和第二载体均独立地包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选为pX458。
[0038]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0039]本专利技术提供用于猪HAT1基因修饰的系统，该系统中含有的第一载体或第二载体，可以表达基因编辑蛋白和sgRNA，对HAT1基因的两个靶位点进行有效酶切，利用供体DNA的修饰片段替换位靶位的待修饰片段，实现HAT1基因序列修饰。
附图说明
[0040]图1为本专利技术实施例1中sgRNA连接pX458载体测序结果。
[0041]图2为本专利技术实施例1中转染候选sgRNA后靶位点的Sanger测序结果。
[0042]图3为本专利技术实施例1中利用ICE软件分析sgRNA
‑
R2基因编辑效率，其基因编辑效率为42％。
[0043]图4为本专利技术实施例1中利用ICE软件分析sgRNA
‑
L3基因编辑效率，其基因编辑效率为36％。
[0044]图5为本专利技术实施例3中HAT1
‑
ssODN序列结构示意图。
[0045]图6为本专利技术实施例3中对HAT1基因进行精准修饰示意图。
[0046]图7为本专利技术实施例5中成对转染sgRNA
‑
R1和sgRNA
‑
L1时，在猪HAT1基因靶位点引起的突变情况。
[0047]图8为本专利技术实施例5中成对转染sgRNA
‑
R2和sgRNA
‑
L2时，在猪HAT1基因靶位点引起的突变情况。
[0048]图9为本专利技术实施例5中成对转染sgRNA
‑
R2和sgRNA
‑
L3时，在猪HAT1基因靶位点引
起的突变情况。
具体实施方式
[0049]本专利技术提供一种用于HAT1基因修饰的系统，该系统含有第一载体、第二载体和供体DNA，其中，第一载体包括基因编辑蛋白表达盒和第一sgRNA表达盒，第二载体包括基因编辑蛋白表达盒和第二sgRNA表达盒，第一sgRNA和第二sgRNA分别本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向猪HAT1基因的CRISPR/Cas载体，其特征在于，其sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和/或2所示。2.猪HAT1基因修饰系统，其特征在于，包含权利要求1所述的CRISPR/Cas载体以及供体DNA；所述供体DNA含有猪HAT1基因第6外显子修饰片段，所述修饰片段编码的氨基酸序列包含猪HAT1蛋白第188位氨基酸由T到A的突变。3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas载体包含基因编辑蛋白表达盒和sgRNA表达盒。4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述基因编辑蛋白选自Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选Cas9。5.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas载体的骨架载体选自pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选pX458。...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志国，牟玉莲，李奎，向光明，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：