一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法技术

一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法，提取家蚕BmN细胞的全部RNA反转录得到的cDNA，以反转录得到的cDNA为模板合成spz基因，再将SEQ ID NO.1所示的spz基因转入家蚕BmN细胞中，可以提高家蚕细胞表达外源蛋白的分泌率。本发明专利技术能有效提高家蚕细胞内表达外源蛋白的分泌效率，为提高家蚕细胞内表达外源蛋白的分泌率提供新的研究方向和思路，为信号肽参与蛋白分泌的机制研究提供参考。蛋白分泌的机制研究提供参考。蛋白分泌的机制研究提供参考。

【技术实现步骤摘要】
一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法。

技术介绍

[0002]随着人类生活水平的提高，健康意识的增强，各种治疗或保健用重组蛋白类药物的需求逐年攀升，同时以生产疫苗、免疫球蛋白、抗体和蛋白质因子等治疗用重组蛋白的生物技术产业产值增速强劲，在生物医药行业中的地位也越来越突出。因此，近年来，有关提高重组蛋白的表达量，尤其是表达量一直偏低的分泌蛋白及膜蛋白的研究广泛受到关注。
[0003]许多蛋白需要分泌到胞外或定位于膜上才能够发挥其生物学功能，而已有多项研究表明，膜蛋白、分泌蛋白表达效率偏低(S Chakrabarti，M Robert
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Guroff，F Wong
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Staal，et al.Expression of the HTLV
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III envelope gene by a recombinant vaccinia virus.1986 Nature.320(6062):535
‑
7.doi:10.1038/320535a0.)。近年来，有关提高在酵母细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞中表达分泌蛋白的研究及专利较多。张欣然等曾公开了一种提高毕赤酵母分泌型外源蛋白表达量的方法，通过将HAC1、ERO1双基因或HAC1、ERO1、BIP三基因在毕赤酵母胞内共表达，有效提高毕赤酵母分泌型外源蛋白的表达量[ZL2014103955743]。也有研究报道利用有效靶向昆虫细胞内质网的蛋白质的信号肽序列，如苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)GP64蛋白或蜂毒素信号肽等，可以大大提高膜蛋白的表达及分泌率[De Pinheiro C G M，Pedrosa M d O，Teixeira N C，et al.，2016.Optimization of canine interleukin
‑
12 production using a bacμLovirus insect cell expression system.BMC Res.Wang B
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Z，Liu W，Kang S
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M，et al.，2007.Incorporation of High Levels of Chimeric Human Immunodeficiency Virus Envelope Glycoproteins into Virus
‑
Like Particles.J.Virol.81(20)]。家蚕在我国有着悠久的饲养历史，家蚕幼虫大，无飞行能力，且能无菌化饲养，因此适合作为“生物工厂”生产重组蛋白质具有很多优势。自从1983年Smith等在家蚕细胞表达干扰素以来，有关在家蚕细胞、幼虫及蛹中表达的蛋白已有上千种。日本学者R Fujita等在2020年成功的在家蚕血淋巴中表达了分泌型SARS
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CoV
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2的S蛋白[Ryosuke Fujita，Masato Hino，Takeru Ebihara，et al.Efficient production of recombinant SARS
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CoV
‑
2 spike protein using the baculovirus
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silkworm system.2020.Biochem Biophys Res Commun,529(2):257
‑
262.doi:10.1016.]，为进一步应用于新冠病毒的检测试剂盒及疫苗等的制备提供理论信息。如果能提高分泌蛋白的分泌量则达到降低蛋白表达成本的作用，进而降低其广泛应用于医药、抗原制备，检测试剂盒等等各方面应用的成本。

技术实现思路

[0004]解决的技术问题：本专利技术公开一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法，利用家蚕BmN细胞的总RNA反转录合成的cDNA作为模板合成spz基因，构建pIZ/V5
‑
spz重组质
粒，转染BmN细胞72h后，可以显著提高细胞中外源蛋白的分泌率。
[0005]技术方案：SEQ ID NO.1所示的spz基因在提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率中的应用。
[0006]稳定表达SEQ ID NO.1所示的spz基因的细胞系在提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率中的应用。
[0007]稳定表达SEQ ID NO.1所示的spz基因的杆状病毒载体在提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率中的应用。
[0008]一种提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率的方法，提取家蚕BmN细胞的全部RNA反转录得到的cDNA，以反转录得到的cDNA为模板合成spz基因，再将SEQ ID NO.1所示的spz基因转入家蚕BmN细胞中。
[0009]有益效果：本专利技术首次发现提取BmN细胞的总RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板合成的spz基因与pIZ/V5载体构建瞬时表达重组质粒并转染BmN细胞后，72h后可以显著提高外源蛋白的分泌率。该方法操作简单，成本低廉，易于推广，能显著提高家蚕细胞表达外源蛋白的分泌效率。本专利技术能有效提高家蚕细胞内表达外源蛋白的分泌效率，为提高家蚕细胞内表达外源蛋白的分泌率提供新的研究方向和思路，为信号肽参与蛋白分泌的机制研究提供参考。本专利技术提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。
附图说明
[0010]图1为利用pIZ/V5
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SP
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Luc和pIZ/V5
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Luc转染BmN细胞筛选稳定细胞系后，又将重组质粒pIZ/V5
‑
spz转入BmN细胞后，以pIZ/V5空载做对照，72h后测得的荧光素酶总表达量。
[0011]图2为利用pIZ/V5
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SP
‑
Luc和pIZ/V5
‑
Luc转染BmN细胞筛选稳定细胞系后，又将重组质粒pIZ/V5
‑
spz转入BmN细胞后，以pIZ/V5空载做对照，72h后测得的上清分泌量。
[0012]图3为72h后利用上清分泌量和总表达量计算得到的分泌率。
具体实施方式
[0013]刘娜等人研究表明(18Additional Amino Acids of the Signal Peptide of the Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus GP64 Activates Immunoglobulin Binding Protein(BiP)Expression by RNA seq Analysis[J].Current Microbiology，2020.doi:10.1007/s00284
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020
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02309
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4.)，在BmN细胞中转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SEQ ID NO.1所示的spz基因在提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率中的应用。2.稳定表达SEQ ID NO.1所示的spz基因的细胞系在提高家蚕细胞表达外源蛋白分泌率中的应用。3.稳定表达SEQ ID NO.1所示的spz基因的杆状病毒载体在提高家蚕细...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢梦泽，侯远琳，霍佳瑶，赵雅婷，姚淙越，郝碧芳，黄金山，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：