一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其方法包括如下步骤：首先从泌乳期和干奶期山羊乳腺组织中分离培养了乳腺上皮细胞，通过免疫染色检测乳腺上皮细胞中角蛋白8的表达，以确定细胞纯度，随后对乳腺上皮细胞进行ATAC

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法


[0001]本专利技术涉及基因表达及整合
，具体为一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法。

技术介绍

[0002]乳腺生物反应器是生产具有生物活性的重组蛋白的理想反应器，具有广阔的应用前景，其关键在于转基因的高水平表达和稳定整合。
[0003]位点特异性基因整合可以减少实验结果的异质性，解决位置效应引起的不稳定性，规范乳腺生物反应器的生产。然而，基因安全港的缺乏，尤其是构建乳腺生物反应器的靶位点的缺乏，阻碍了该技术的应用。为了解决这一问题，我们筛选出了可用于制备乳腺生物反应器的基因整合位点，来帮助在奶山羊乳腺生物反应器中生产重组蛋白。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其方法包括如下步骤：
[0006](1)首先从泌乳期和干奶期山羊乳腺组织中分离培养了乳腺上皮细胞；
[0007](2)通过免疫染色检测乳腺上皮细胞中角蛋白8的表达，以确定细胞纯度；
[0008](3)对乳腺上皮细胞进行ATAC
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seq和RNA
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seq；
[0009](4)对ATAC
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seq和RNA
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seq数据进行了Venn分析，以筛选泌乳期蛋白表达量高和染色质可及性高的基因；
[0010](5)在排除被敲除后对宿主有害的基因后，得到两个候选靶位点UACA(ATAC
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seqmaximumsignalvalue:72.90)和ANTXR1(ATAC
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seqmaximumsinglevalue:174.91)；
[0011](6)在染色质开放性高于ANTXR1的基因位点中按照上述步骤进行筛选，得到16个候选打靶区域，并在比较了奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源性后，最终选择8个打靶位点；
[0012](7)针对步骤(6)中不同的候选靶位点共构建8个供体载体和相应的Cas9一元表达载体，并将ROSA26位点作为对照，并根据不同的靶位点替换相应的同源臂和sgRNA序列；
[0013](8)在293T细胞中进行SSA检测，构建针对这些位点的最优Cas9
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sgRNA打靶载体；
[0014](9)通过电穿孔将供体载体和打靶载体转入奶山羊乳腺上皮细胞内，将BLG
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hLYZ分别插入基因组中的不同靶位点，经嘌呤霉素筛选后，通过5'JunctionPCR和3'JunctionPCR鉴定得到阳性细胞克隆，扩大培养后，加入诱导培养基诱导乳腺上皮细胞表达重组人溶菌酶；
[0015](10)采用BCA法检测总蛋白浓度，并调整上样量使总蛋白量一致，然后进行westernblot检测，得到实验结果。
[0016]优选的，所述步骤(1)中，分离培养乳腺上皮细胞的方法为组织块贴壁法。
[0017]优选的，所述步骤(1)中，所分离培养的乳腺上皮细胞为3对。
[0018]优选的，所述步骤(4)中，所筛选的蛋白表达量和染色质可及性均要高于平均水平。
[0019]优选的，所述步骤(6)中，在由16个候选打靶区域到8个打靶位点的过程中，需要比较奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源性。
[0020]优选的，所述步骤(7)中，8个载体的基本结构为pBLG
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hLYZ
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EGFP
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PuroR
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pEF1α。
[0021]优选的，所述步骤(9)中，当细胞在60mm培养皿中生长至70％～80％时，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养72h后再收集细胞。
[0022]优选的，所述步骤(9)中，将克隆来源相同的阳性细胞进行传代培养，形成同源的两皿细胞，分别收集样品提取RNA和蛋白质。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0024]本专利技术通过筛选出可用于制备乳腺生物反应器的基因整合位点FAM13A，并在细胞水平上验证了该位点的有效性和安全性，将有助于在奶山羊乳腺生物反应器中生产重组蛋白。该增强转基因表达的方法，结合ATAC
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seq和RNA
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seq来筛选奶山羊泌乳期乳腺上皮细胞染色质特异性开放的区域，并利用CRISPR/Cas9将人溶菌酶基因整合到4个不同的开放区域，通过比较在不同打靶位点插入基因的表达水平，筛选出有利于转基因表达的整合位点FAM13A。
附图说明
[0025]图1为本专利技术基因表达示意图；
[0026]图2为本专利技术统计图。
具体实施方式
[0027]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0028]实施例一：一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其方法包括如下步骤：
[0029](1)首先从泌乳期和干奶期山羊乳腺组织中分离培养了乳腺上皮细胞；
[0030](2)通过免疫染色检测乳腺上皮细胞中角蛋白8的表达，以确定细胞纯度；
[0031](3)对乳腺上皮细胞进行ATAC
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seq和RNA
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seq；
[0032](4)对ATAC
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seq和RNA
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seq数据进行了Venn分析，以筛选泌乳期蛋白表达量高和染色质可及性高的基因；
[0033](5)在排除被敲除后对宿主有害的基因后，得到两个候选靶位点UACA(ATAC
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seqmaximumsignalvalue:72.90)和ANTXR1(ATAC
‑
seqmaximumsinglevalue:174.91)；
[0034](6)在染色质开放性高于ANTXR1的基因位点中按照上述步骤进行筛选，得到16个候选打靶区域，并在比较了奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源
性后，最终选择8个打靶位点；
[0035](7)针对步骤(6)中不同的候选靶位点共构建8个供体载体，并将ROSA26位点作为对照，并根据不同的靶位点替换相应的同源臂和sgRNA序列；
[0036](8)在293T细胞中进行SSA检测，构建针对这些位点的最优Cas9
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sgRNA打靶载体；
[0037](9)通过电穿孔将供体载体和打靶载体转入奶山羊乳腺上皮细胞内，将BLG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定外源基因整合位点以增强转基因表达的方法，其特征在于，其方法包括如下步骤：(1)首先从泌乳期和干奶期山羊乳腺组织中分离培养了乳腺上皮细胞；(2)通过免疫染色检测乳腺上皮细胞中角蛋白8的表达，以确定细胞纯度；(3)对乳腺上皮细胞进行ATAC
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seq和RNA
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seq；(4)对ATAC
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seq和RNA
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seq数据进行了Venn分析，以筛选泌乳期蛋白表达量高和染色质可及性高的基因；(5)在排除被敲除后对宿主有害的基因后，得到两个候选靶位点UACA(ATAC
‑
seqmaximumsignalvalue:72.90)和ANTXR1(ATAC
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seqmaximumsinglevalue:174.91)；(6)在染色质开放性高于ANTXR1的基因位点中按照上述步骤进行筛选，得到16个候选打靶区域，并在比较了奶山羊与小鼠中这些基因的核苷酸序列以及氨基酸序列的同源性后，最终选择8个打靶位点；(7)针对步骤(6)中不同的候选靶位点共构建8个供体载体和相应的Cas9一元表达载体，并将ROSA26位点作为对照，并根据不同的靶位点替换相应的同源臂和sgRNA序列；(8)在293T细胞中进行SSA检测，构建针对这些位点的最优Cas9
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sgRNA打靶载体；(9)通过电穿孔将供体载体和打靶载体转入奶山羊乳腺上皮细胞内，将BLG
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hLYZ分别插入基因组中的不同靶位点，经嘌呤霉素筛选后，通过5'JunctionPCR和3'JunctionPCR鉴定得到阳性细胞克隆，扩大培养后，加入诱导培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，张涌，高元鹏，祝振亮，韩静，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：