一种结核病的检测方法技术

本发明专利技术涉及医药分子生物学技术领域，采用传统PCR技术扩增目标靶基因DNA序列，利用T7转录生成ssRNA，利用cas

【技术实现步骤摘要】
一种结核病的检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及结核分枝杆菌的检测方法。

技术介绍

[0002]规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系统是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫系统，CRISPR
‑
Cas系统是存在于约48％的细菌和约80％的古细菌中的自适应免疫系统。CRISPR基因座在大肠杆菌中以高度同源的重复序列呈现。依据Cas基因与位点结构之间的序列相似性将CRISPR
‑
Cas系统分为两大类：第一类系统(包括括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型)存在于细菌和古细菌中，通常形成多亚基蛋白
‑
crRNA效应复合物；第二类系统(包括Ⅱ、
Ⅴ
和
Ⅵ
型)依赖于一个单一的crRNA引导蛋白进行目标干扰。其中能够非特异性切割单链RNA的Cas13a属于VI类，VI类中还有Cas13b、Cas13c等几种亚型。Cas13a(二类
Ⅵ‑
A型)不同于其他的两类CRISPR效应蛋白，其缺少一个DNA酶的结构域，具有两个保守的高等真核生物及原核生物核酸结合功能区，该功能区使其具有了RNA酶的活性。Cas13是第一个被描述用于RNA引导RNA靶向的单蛋白效应器，独特的RNA靶向机制，为RNA引导的RNA靶向研究提供了新思路。
[0003]CRISPR
‑
Cas13a检测技术在感染性疾病诊断中的应用如：Cas13a对靶点RNA序列识别后可呈现出强大且对非特异RNA序列的“平行切割”效应。East
‑
Seletsky等首次利用LbuCas13a蛋白对目标RNA的核酸进行检测，结果表明仅能对10pmol/L的RNA分子进行检测，无法达到临床诊断的检测要求。随后，Gootenberg等发现检测效率更高的LwCas13a蛋白，并首次将其与重组聚合酶等温扩增技术(reconbinase polymeraseamplificationRPA)结合，建立敏感度达单拷贝、特异性达单碱基的高敏感、高特异性核酸检测方法SHERLOCK，该系统可用于生物样本(血液或尿液)中寨卡以及登革热病毒的检测，并且可以进一步区分其特定型别(如非洲寨卡和美洲寨卡)，鉴定病原菌以及人体内游离的突变肿瘤DNA。Myhrvold等开发出一种与SHERLOCK配对可直接从体液中检测病毒的HUDSON技术可以在2h内从患者的全血、血清和唾液样本中高度敏感地检测出登革热病毒，同时可区分4种登革热病毒血清型，以及2015至2016年流行的寨卡病毒区域特异株。
[0004]结核病(Tuberculosis，TB)由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的古老的慢性传染病至今依然严重危害人类健康，因此对潜伏感染者的早期精准干预意义重大。
[0005]目前，临床上诊断肺结核的方法仍是影像学及细菌学，痰涂片抗酸染色法简单、快速、经济，但敏感性差，痰菌培养周期长，不利于临床结核病的诊断和治疗。针对结核分枝杆菌核酸的检测主要有GenXpert和PCR法检测痰液中的结核分枝杆菌TB基因，GenXpert的敏感度和特异度均明显升高，但其费用高，在基层单位尚未完全普及。在于佳佳等人的研究中，将PCR扩增技术与CRISPR_Cas13a检测技术相结合，通过对含MTB DNA的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行敏感度及特异度分析，研究结果表明不同浓度质粒模板和标准菌株H37Rv的敏感度，敏感度在拷贝数10拷贝/ul和100拷贝/ul时较好。
[0006]CRISPR/Cas系统在医学等领域的有效应用受到了脱靶效应的影响，同时CRISPR/Cas系统在不同基因组位点的切割效率具有一定差异，因此，CRISPR_Cas13a技术的应用随着目标序列的不同，其检测的灵敏度会受到显著的影响，寻找特异性更强、互补识别更精确的的目标序列成为更好的使用CRISPR CAS13a RNA酶技术的关键因素。尤其在结核病和耐药的准确诊断中迫切需要一种快速、高效、敏感、经济的结核分枝杆菌诊断方法。

技术实现思路

[0007]基于CRISPR
‑
Cas系统中Cas13a蛋白具有RNA酶的活性，可在CRISPR RNA(crRNA)的引导下识别目标靶序列的单链核糖核酸(single
‑
stranded ribonucleic acid，ssRNA)，并进行剪切，同时还可对非目标RNA进行非特异剪切特性，具有信号放大的功能。CRISPR_Cas13a技术的应用随着目标序列的不同，其检测的灵敏度会受到显著的影响，寻找特异性更强、互补识别更精确的的目标序列成为更好的使用CRISPR CAS13a RNA酶技术的关键因素，本专利技术确定了结核分枝杆菌的特定crDNA序列，能够高效、精准的与CRISPR CAS13a RNA酶互补识别，实现低拷贝特定目标靶基因的高灵敏度检测，提供了一个简单、快速、无须昂贵设备即可进行结核分枝杆菌的检测方法。因此，
[0008]第一方面，本专利技术提供一组用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA序列，所述crDNA序列可被T7转录生成crRNA，进而能够被CRISPR Cas13a所识别；所述crDNA选自如下序列：
[0009]IS1081
‑
a crDNA
[0010]GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTTCGGACCCGCCCGCTCGATGCCGGCCC(SEQ IN NO:1)
[0011]IS1081
‑
b crDNA
[0012]GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGTATAC(SEQ IN NO:2)
[0013]IS1081
‑
c crDNA
[0014]GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCCCGCAGCGGCCTGGCAGCGCTGCAGA(SEQ IN NO:3)
[0015]IS1081
‑
d crDNA
[0016]GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGACTGGC(SEQ IN NO:4)
[0017]IS1081
‑
e crDNA
[0018]GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCGGACCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGT(SEQ IN NO:5)；
[0019]该crDNA序列是转录为RNA序列时能够被CRISPR Cas13a所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
IN NO:2)IS1081
‑
c crDNAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCCCGCAGCGGCCTGGCAGCGCTGCAGA(SEQ IN NO:3)IS1081
‑
d crDNAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGACTGGC(SEQ IN NO:4)IS1081
‑
e crDNAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCGGACCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGT(SEQ IN NO:5)。5.如权利要求4所述一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于所述crDNA序列可被T7 RNA聚合酶识别合成crRNA，进而能够被CRISPR Cas13a所识别。6.一种用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA在制备检测结核分枝杆菌试剂盒中的用途。7.如权利要求6所述一种用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA在制备检测结核分枝杆菌试剂盒中的用途。8.一种PCR扩增技术联合CRISPR
‑
Cas13a系统在检测结核分枝杆菌的方法中的应用；所述应用包括以下步骤：S01提取待测样本的DNA作为检测模板；S02检测模板通过设...

【专利技术属性】
技术研发人员：逄宇，任卫聪，李传友，李姗姗，
申请(专利权)人：北京市结核病胸部肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：