靶向NPM蛋白的肽适配子及其多肽药物和应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向NPM蛋白的肽适配子及其多肽药物和应用。本发明专利技术公开了四个靶向结合NPM蛋白的肽适配子序列，亲和性高、特异性强，动物实验显示其具有抗肿瘤生长、抑制肝纤维化等功能。因此，本发明专利技术极具应用价值。本发明专利技术通过双分子荧光互补技术，从高通量文库中筛选获得了靶向结合NPM蛋白的候选肽适配子；利用免疫共沉淀技术，确定了能靶向结合NPM蛋白的特异肽适配子；利用靶向结合NPM蛋白的肽适配子序列，体外合成了能透膜进入细胞的小分子多肽药物sp10和sp177；利用肝癌细胞的皮下移植瘤技术，确证了sp10具有抗肿瘤生长的作用；利用肝星状细胞模型和肝纤维化小鼠模型，证实了sp177具有抑制肝星状细胞迁移能力、抑制小鼠肝纤维化进展的作用。肝纤维化进展的作用。

【技术实现步骤摘要】
靶向NPM蛋白的肽适配子及其多肽药物和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及到筛选和确定靶向结合NPM蛋白的具有抗肿瘤作用或抗肝纤维化作用的肽适配子。

技术介绍

[0002]双分子荧光互补技术是一种直观、快速判断目标蛋白在活细胞中定位和相互作用的技术，该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达。如果荧光蛋白活性恢复，则表明两目标蛋白发生了相互作用。该技术已用于不同蛋白间相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作。
[0003]适配子技术是指利用筛选的适配子对靶标进行定位、检测和功能生物学研究的技术。适配子具有长的半衰期、无毒且能通过无免疫原性的靶分子筛选获得的特性，而且它们也可以很容易通过化学合成或表达系统产生。肽适配子是指从随机蛋白表达文库中筛选针对蛋白质靶标的短肽分子，这些从高容量的文库中筛选获取的短肽分子能特异地与靶标结合，从而影响靶标的功能，可应用于靶标及其复合物功能的干预研究。经典的肽适配子筛选主要通过酵母双杂交技术从随机肽表达文库中筛选获得。为了稳定源自于随机表达文库的肽适配子的构象，可将一系列编码肽适配子的可变阅读框架插入至一个支架蛋白框架(通常是细菌的硫氧还蛋白)以形成融合蛋白，借此，融合的肽适配子能形成特定的蛋白构象以利于肽适配子和靶分子之间的相互结合。
[0004]NPM蛋白(核仁磷酸蛋白)是一个强大的增殖促进因子，在多个肿瘤的恶性进程(如肿瘤发生、肿瘤细胞增殖，迁移，侵袭转移，肿瘤干细胞特性维持、化疗药物抗性等)具有促进作用。因此，获得能靶向该蛋白的小分子药物不仅可以为NPM蛋白功能分析提供一个有效工具，而且经过修饰，可能由此获得能对特定肿瘤、肝纤维化等细胞增殖相关疾病具有一定疗效的肽适配子药物。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供靶向NPM蛋白的肽适配子及其多肽药物和应用，提供了一组能靶向结合NPM蛋白的肽适配子序列，进而合成能抑制细胞增殖相关疾病的肽适配子药物。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
[0007]靶向NPM蛋白的肽适配子，包括S10、S34、S140或S177中的至少一种；其中：
[0008]S10的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，S10的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0009]S34的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，S34的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0010]S140的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，S140的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；
[0011]S177的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，S177的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0012]具体地，本专利技术鉴定出的四种能靶向NPM蛋白的肽适配子，其编号、核苷酸序列和氨基酸序列分别如下：
[0013]编号核苷酸序列肽适配子的肽段序列
S10TTCTTAATTTTTTCTTATTTTTTATTTTTTTCGFLIFSYFLFFSS34TGTGCACGTTTTTTAGGTATATCTTTTTTTTTGCARFLGISFFIS140CTCACATACATTCTTTTAGTTTTTTCTTCTGTGLTYILLVFSSVS177TTTTTGCATACTAATGTTTTTTTTTTTTTTTTGFLHTNVFFFFL
[0014]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
[0015]多肽，包括sp10或sp177中的至少一种；其中：
[0016]所述多肽sp10的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，即：
[0017]YGRKKRRQRRRCGPVWFLIFSYFLFFSISLARGPC(C12
‑
C35)；第12和第35个氨基酸(半胱氨酸)进行交联；
[0018]所述多肽sp177的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，即：
[0019]YGRKKRRQRRRCGPVWFLHTNVFFFFLISLARGPC(C12
‑
C35)；第12和第35个氨基酸(半胱氨酸)进行交联。
[0020]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
[0021]本专利技术鉴定出的靶向NPM蛋白的肽适配子(尤其是编号S10、S177)及其体外合成的小分子肽sp10、sp177具有抗增殖性细胞生长活性。因此，本专利技术同时提供了：
[0022]所述靶向NPM蛋白的肽适配子S10、S34、S140或S177在制备NPM蛋白相关疾病的预防或治疗药物中的应用。
[0023]所述的多肽sp10或多肽sp177在制备NPM蛋白相关疾病的预防或治疗药物中的应用。
[0024]具体地，所述NPM蛋白相关疾病包括肿瘤，例如肝癌等。
[0025]具体地，所述NPM蛋白相关疾病还包括肝纤维化。
[0026]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之四是：
[0027]一种靶向NPM蛋白的肽适配子的筛选鉴定方法，利用基于双分子荧光互补的肽适配子文库，以pBiFc
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VN173
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NPM为靶标，筛选获得靶向结合NPM的候选肽适配子；通过表达载体构建和免疫共沉淀技术，从候选肽适配子中鉴定能特异高亲和结合NPM的肽适配子；利用体外合成方法，合成含有肽适配子序列的小分子多肽药物；通过体内或体外实验验证其活性，例如利用肝癌细胞的皮下移植瘤实验，鉴定了含有肽适配子的小分子多肽药物的抗肿瘤作用。
[0028]其中，利用克隆技术和载体构建技术，将经过PCR和酶切获得的具有特定黏性末端的NPM开放阅读框定向插入至pBiFc
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VN173中，获得pBiFc
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VN173
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NPM表达载体。
[0029]其中，所述的靶向结合NPM蛋白的候选肽适配子，统称为TrxA
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peptide
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TrxA，peptide为包含11个随机氨基酸的短肽，特别指上述四种不同的肽适配子的氨基酸序列，通过位于TrxA中的半胱氨酸形成二硫键，以形成固定的构象，特异短肽位于TrxA表达框中。
[0030]其中，利用体外合成技术，合成了含有该肽适配子序列的小分子多肽药物，用于NPM表达导致的细胞增殖相关的疾病治疗。
[0031]在本专利技术的一个具体的实施例中，靶向NPM蛋白的肽适配子筛选和功能鉴定方法，包括以下步骤：
[0032]1)应用设计引物，以双分子荧光互补获取的候选肽适配子TrxA
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peptide
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TrxA为模板，对TrxA
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peptide
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TrxA进行高保真PCR扩增；
[0033]2)利用酶切连接方法将候选肽适配子TrxA
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peptide
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TrxA转移入p本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向NPM蛋白的肽适配子，其特征在于：包括S10、S34、S140或S177中的至少一种；其中：所述S10的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述S10的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述S34的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述S34的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述S140的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述S140的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述S177的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述S177的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。2.权利要求1所述的靶向NPM蛋白的肽适配子在制备NPM蛋白相关疾病的预防或治疗药物中的应用。3.多肽，其特征在于：所述多肽包括sp10或sp177中的至少一种；其中：所述sp10的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；所述sp177的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。4.权利要求3所述的多肽在制备NPM蛋白相关疾病的预防或治疗药物中的应用。5.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于：所述NPM蛋白相关疾病包括肿瘤或肝纤维化。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述NPM蛋白相关疾病包括肝癌。7.一种靶向NPM蛋白的肽适配子的筛选鉴定方法，其特征在于：利用基于双分子荧光互补的肽适配子文库，以NPM蛋白为靶标，筛选获得靶向结合NPM蛋白的候选肽适配子；通过表达载体构建和免疫共沉淀技术，从候选肽适配子中鉴定能特异高亲和结合NPM蛋白的肽适配子；体外合成含有所述肽适配子序列的小分子多肽药物，通过体内或体外实验验证其活性。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：利用克隆技术和载体构建技术，将经过PCR和酶切获得的具有特定黏性末端的NPM开放阅读框定向插入至pBiFc
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VN173中，获得pBiFc
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VN173
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NPM表达载体。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的靶向结合NPM蛋白的候选肽适配子为TrxA
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peptide<...

【专利技术属性】
技术研发人员：石松林，朱新乐，冯娴，刘宽灿，杨玲，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：