一种双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术适用于生命科学技术领域，提供了一种双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法及其应用，包括如下步骤：步骤（1）表位的选择和修饰；步骤（2）Au纳米星和Ag纳米粒子的合成；步骤（3）基底材料的选择及β－环糊精功能化；步骤（4）偶氮苯修饰的表位模板在基底材料上的锚定；步骤（5）定向表面印迹；步骤（6）偶氮苯修饰的表位模板的去除。本发明专利技术中的一种双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法，制备的双重主客体锚定表位印迹聚合物与目标蛋白形成夹心复合物，以构建基于MIPs

【技术实现步骤摘要】
一种双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生命科学
，尤其涉及一种双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，蛋白质的分析方法主要有免疫分析、肽质量指纹图分析、氨基酸序列分析和氨基酸组成分析等，质谱法是目前最广泛使用的蛋白质鉴定方法，但是随着医疗水平的提高，临床诊断需要检测限更低，灵敏度更高的检测方法。表面增强拉曼散射（SERS）技术的灵敏度已经达到单分子水平，适用于痕量检测并且具有检测快速、分辨率高等特点。
[0003]目前比较普遍的蛋白质研究手段的主要基础是抗原－抗体识别，抗体在生命科学领域中生物分子识别方面是人们普遍使用的生物试剂，但是抗体也存在很多缺点，制备过程复杂，价格高昂，一些抗体难以提纯或很难制备，并且抗体不稳定，重复性差，因此发展抗体的替代物不仅具有重要的科学意义，而且具有巨大的经济价值。
[0004]而分子印迹聚合物（MIPs）价格低廉，制备容易，对恶劣环境耐受力强，稳定性好，可重复使用，可以在复杂环境中选择性识别目标物，但传统分子印迹技术使用整个蛋白作为模板有很多缺点：可用的聚合体系在维持模板蛋白的天然构象方面受到限制，以及难以获得大量高纯度的模板蛋白，尤其是低丰度蛋白，相对较大的印迹位点易于与许多较小的非靶结合，导致选择性降低，所有这些问题阻碍了蛋白质印迹材料的广泛应用。
[0005]因此，针对以上现状，迫切需要开发一种双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法及其应用，以克服当前实际应用中的不足。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的不足，本专利技术实施例的目的在于提供一种双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法及其应用，以解决上述
技术介绍
中的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤：步骤（1）、选择目标蛋白的C端和N端表位的氨基酸序列并对其进行修饰；步骤（2）、Au纳米星和Ag纳米粒子的合成；步骤（3）、基底材料的选择及β－环糊精功能化；步骤（4）、偶氮苯修饰的表位模板在基底材料上的锚定；步骤（5）、定向表面印迹；步骤（6）、偶氮苯修饰的表位模板的去除，得到分子印迹聚合物。
[0008]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤（1）中，对于目标蛋白C端的修饰，先引入赖氨酸，再利用赖氨酸上的氨基与4
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（苯基偶氮）苯甲酸进行反应，得到偶氮苯修饰的C端表位；对于目标蛋白N端的修饰，其末端存在可反应的氨基，直接与4
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（苯基偶氮）苯甲酸
反应，得到偶氮苯修饰N端表位。
[0009]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤（2）中，配置0.1molHEPES水溶液，通过滴加1molNaOH溶液将pH值调节至7.4，将超纯水加入到2mLHEPES中，再加入40μL1%HAuCl4，混合物在不搅拌的情况下反应1h，得到蓝色AuNSs溶液；将含有0.0090g AgNO3的50 mL超纯水加热，沸腾后加入1 mL 1%柠檬酸三钠溶液，煮沸1h后，将该溶液冷却得到AgNPs。
[0010]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤（3）中，C端表位选择β－环糊精功能化的玻璃基底，N端表位选择β－环糊精和拉曼报告分子功能化的Ag纳米粒子，β－环糊精功能化玻璃基底的具体合成步骤如下：步骤（11）、制作氨基功能化的玻璃基底，将玻璃基底切成若干等分，并在其表面刻上大小相等的小圆圈，用食人鱼溶液和超纯水依次对玻璃基底进行冲洗；步骤（12）、将玻璃基底浸入4%APTES的乙醇溶液中12h，并用乙醇清洗干净后干燥；步骤（13）、将步骤（12）得到的玻璃基底浸泡在10mLAuNSs溶液中过夜，并用超纯水对其进行冲洗；步骤（14）、用含有SH
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β－环糊精的水溶液浸泡玻璃基底，超纯水冲洗后得到β－环糊精功能化的玻璃基底。
[0011]作为本专利技术进一步的技术方案，β－环糊精和拉曼报告分子功能化的Ag纳米粒子基底的合成步骤如下：步骤（21）、将含有0.0090g AgNO3的50 mL超纯水加热，沸腾后加入1 mL 1%柠檬酸三钠溶液，煮沸1h后，将该溶液冷却得到AgNPs；步骤（22）、在AgNPs溶液里添加含拉曼报告分子的乙醇溶液，进行混合搅拌后，加入β－环糊精水溶液搅拌混合并过夜，得到β－环糊精和拉曼报告分子功能化的银纳米粒子基底。
[0012]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤（4）中，将β－环糊精功能化修饰的基底材料浸入含有偶氮苯修饰的表位模板的缓冲液中，调节pH值和孵育温度，对其进行孵育，使得偶氮苯修饰的表位模板锚定在β－环糊精功能化修饰的基底材料上。
[0013]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤（5）中，在已经锚定表位模板的基底材料加入到含有水、氨水及硅烷化试剂功能单体的乙醇溶液中进行印迹。
[0014]作为本专利技术进一步的技术方案，在步骤（6）中，将完成印迹的基底材料，在365nm光的照射下浸泡入洗脱液中并进行反应，表位模板清除后，得到分子印迹聚合物。
[0015]本专利技术还提供根据上述方法制备的双重主客体锚定表位印迹聚合物的应用，双重主客体锚定表位印迹聚合物用于对小细胞肺癌患者进行诊断。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：选择目标蛋白的C端和N端多肽分别作为表位，经过处理，偶氮苯修饰的多肽作为印迹模板，模板通过主客体作用锚定于环糊精功能化的基底上，然后选择不同种类和摩尔配比的硅烷化试剂作为功能单体反应不同时间进行印迹，得到主客体锚定表位印迹聚合物，制备的双重主客体锚定表位印迹聚合物应用于小细胞肺癌患者的诊断，且具备所需样本量小、线性范围宽以及成本低，选择性识别能力高，检测方法灵敏度高等优势。
[0017]为更清楚地阐述本专利技术的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本专利技术进行详细说明。
附图说明
[0018]图1为本专利技术实施例提供的双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法的原理图。
[0019]图2为本专利技术实施例提供的制备方法中C端和N端表位氨基酸分子式的原理图。
[0020]图3为本专利技术实施例提供的不同材料在透射电子显微镜下的表征图。
[0021]图4为本专利技术实施例提供的载玻片上水接触角的示意图。
[0022]图5为本专利技术实施例提供的不同材料在扫描电子显微镜下的表征图。
[0023]图6为本专利技术实施例提供的不同材料的X射线电子能谱图。
[0024]图7为本专利技术实施例提供的不同材料的紫外光谱图。
[0025]图8为本专利技术实施例提供的AgNPs、Ag/PATP NPs、固定N端表位的AgNPs和N端印迹的AgNPs的表面增强拉曼光谱图。
[0026]图9为本专利技术实施例提供的印迹单体和印迹时间的优化统计图。
[0027]图10为本专利技术实施例提供的C端表位印迹聚合物和N端表位印迹聚合物的特异性考察对比图。
[0028]图11为本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1）、选择目标蛋白的C端和N端表位的氨基酸序列并对其进行修饰；步骤（2）、Au纳米星和Ag纳米粒子的合成；步骤（3）、基底材料的选择及β－环糊精功能化；步骤（4）、偶氮苯修饰的表位模板在基底材料上的锚定；步骤（5）、定向表面印迹；步骤（6）、偶氮苯修饰的表位模板的去除，得到分子印迹聚合物。2.根据权利要求1所述的双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，对于目标蛋白C端的修饰，先引入赖氨酸，再利用赖氨酸上的氨基与4
‑
（苯基偶氮）苯甲酸进行反应，得到偶氮苯修饰的C端表位；对于目标蛋白N端的修饰，其末端存在可反应的氨基，直接与4
‑
（苯基偶氮）苯甲酸反应，得到偶氮苯修饰N端表位。3.根据权利要求1所述的双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，配置0.1molHEPES水溶液，通过滴加1molNaOH溶液将pH值调节至7.4，将超纯水加入到2mLHEPES中，再加入40μL1%HAuCl4，混合物在不搅拌的情况下反应1h，得到蓝色AuNSs溶液；将含有0.0090g AgNO3的50 mL超纯水加热，沸腾后加入1 mL 1%柠檬酸三钠溶液，煮沸1h后，将该溶液冷却得到AgNPs。4.根据权利要求1所述的双重主客体锚定表位印迹聚合物的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，C端表位选择β－环糊精功能化的玻璃基底，N端表位选择β－环糊精和拉曼报告分子功能化的Ag纳米粒子基底，β－环糊精功能化玻璃基底的具体合成步骤如下：步骤（11）、制作氨基功能化的玻璃基底，将玻璃基底切成若干等分，并在其表面刻上大小相等的小圆圈，用食人鱼溶液和超纯水依次对玻璃基底...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾琼，许伊童，马玖彤，郑海娇，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：