ATP依赖性DNA连接酶制造技术

本发明专利技术涉及连接酶领域。更具体地说，本发明专利技术涉及新的并且高效的ATP依赖性DNA连接酶，其具有独特的连接酶活性，使得该连接酶在各种分子生物学技术中特别有用。此外，本发明专利技术涉及包含所述DNA连接酶的组合物和试剂盒、其制造和使用方法。使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】ATP依赖性DNA连接酶


[0001]本专利技术涉及连接酶领域。更具体地，本专利技术涉及ATP依赖性DNA连接酶、包含该DNA连接酶的试剂盒和组合物、制造和使用方法。

技术介绍

[0002]DNA连接酶催化正确对齐的DNA序列中5
’‑
磷酰基和3
’‑
羟基端基之间的DNA糖
‑
磷酸骨架中磷酸二酯键的形成。体内连接酶在修复切口以及对DNA复制和修复至关重要的单链和双链断裂中发挥重要作用。
[0003]除了对DNA复制和修复很重要外，从噬菌体中分离的DNA连接酶，如T4 DNA连接酶，几十年来一直广泛用于分子生物学，用于将DNA片段插入载体中以用于重组质粒构建、下一代DNA测序文库构建和dsDNA环化中的衔接子连接，参见"Ligases",Enzyme Resources Guide.Promega Corporation.pp.8
–
14。
[0004]DNA连接酶催化一条DNA链的3
’‑
羟基端基与另一条的相邻5
>’‑
磷酰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶活性片段，其中，所述DNA连接酶包含SEQ ID No.1的氨基酸序列或包含与SEQ ID No.1具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述DNA连接酶能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子的存在下将3
’‑
羟基
‑
脱氧核糖核酸分子连接到5
’
磷酰基
‑
核糖核酸分子的5
’‑
端。2.根据权利要求1所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中，所述DNA连接酶包含与SEQ ID No.1具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中，所述DNA连接酶具有选自以下各项的氨基酸序列：(a)SEQ ID No.1或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，(b)SEQ ID No.7或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，(c)SEQ ID No.10或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列，或(d)SEQ ID No.16或与其至少80％同一性的氨基酸序列，并且其中所述DNA连接酶能够在跨越连接点的互补脱氧核糖核酸分子存在下将3
’‑
羟基
‑
脱氧核糖核酸分子连接到5
’
磷酰基
‑
核糖核酸分子的5
’‑
端。4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段，其中，所述DNA连接酶具有选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.16和SEQ ID No.17中任一项的氨基酸序列。5.一种重组核酸分子，编码根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段，或编码包含所述分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段的蛋白质。6.根据权利要求5所述的重组核酸分子，其中，所述核酸分子包含SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18或者SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18的密码子优化序列，或者由SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18或者SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18的密码子优化序列组成。7.根据权利要求5所述的重组核酸分子，其中，所述核酸分子包含从SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18或者SEQ ID No.3、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.18的简并版本中任一项选择的核酸分子或者由该核酸分子组成。8.一种载体，包含编码根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促活性片段的核酸分子，或者包含根据权利要求5至7中任一项所述的核酸分子或由该核酸分子组成，其中所述载体是重组表达载体、克隆载体、质粒、病毒载体、粘粒、λ噬菌体或细菌人工染色体。9.一种宿主细胞，包含根据权利要求8所述的载体，其中所述细胞是酵母细胞、昆虫细胞、人类细胞系或细菌细胞。10.一种组合物，包含根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段。11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物还包含缓冲剂，优选所述缓冲剂包含ATP和二价阳离子，其中所述二价阳离子优选为Mn
2+
或Mg
2+
。12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中，所述组合物是用于施用到包含待连接的核酸分子的样品的溶液。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含至少一种第一3
’‑
羟基
‑
脱氧核糖核酸分子、至少一种5
’
磷酰基
‑
核糖核酸分子和至少一种第二互补脱氧核糖核酸分子，其中所述DNA连接酶能够在跨越连接点的所述至少一种互补脱氧核糖核酸分子存在下将所述至少一种第一3
’‑
羟基
‑
脱氧核糖核酸分子连接至所述至少一种5
’
磷酰基
‑
核糖核酸分子的5
’
端。14.一种用于将脱氧核糖核酸分子连接到核糖核酸分子末端的试剂盒，包含：a.第一容器，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的分离的ATP依赖性DNA连接酶或其酶促片段、或根据权利要求10所述的组合物；b.第二容器，其包含包含连接缓冲液，所述连接缓冲液包含ATP和二价阳离子；c.和可选地第三容器，其包含待连接到5
’‑
磷酰基
‑
核糖核酸分子的5
’
端的至少一种第一3
’‑
羟基
‑
脱氧核糖核酸分子以及至少一种第二脱氧核糖核酸分子，其中所述至少一种第二脱氧核糖核酸分子包含3
’
区和5
’
区，其中所述3
’
区与第一脱氧核糖核酸分子互补，并且所述5
’
区是与包含已知序列的核糖核酸分子互补的序列或所述5
’
区是简并的序列以便结合具有未知序列或包含不同序列的核糖核酸分子，并且其中所述第一脱氧核糖核酸分子和所述第二脱氧核糖核酸分子可以是预杂交复合物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：贝恩德，
申请(专利权)人：阿克蒂克塞姆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：