利用动态代谢控制从木糖生产木糖醇的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及用于木糖醇生产的基因工程微生物菌株和相关生物工艺。特别地，使用动态控制的合成代谢阀来降低某些酶的活性，导致两阶段工艺中木糖醇产量的增加。段工艺中木糖醇产量的增加。段工艺中木糖醇产量的增加。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用动态代谢控制从木糖生产木糖醇的方法和组合物
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求于2020年4月3日提交的第63/004,740号和2020年7月24日提交的第63/056,085号美国临时专利申请的优先权，此两项专利申请的全部内容通过引用并入本文。


[0002]本专利技术涉及代谢工程微生物，例如细菌菌株，以及利用此类菌株的生物工艺。这些菌株对导致从木糖生产木糖醇的代谢途径进行了动态控制。序列表
[0003]本申请包含序列表，该序列表已于2021年3月29日以ASCⅡ格式电子提交为49196
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46_ST25，其大小为17051字节，其全部内容通过引用并入本文。联邦资助的研究或开发
[0004]本专利技术是在由能源部授予的联邦拨款第EE0007563号；由美国国防部授予的联邦合同编号HR 0011
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0075；由美国国防部授予的联邦拨款第ONR YIP 120439560号；DARPA#HR 0011
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0075；ONR YIP#N 00014
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2558；由DOE EERE资助的#EE0007563；由NAVY/ONR资助的N00014
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2558的政府支持下，以及由NIH生物技术培训资助(T32GM008555)下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。

技术介绍

[0005]木糖醇是一种工业糖醇，主要用作甜味剂，其甜度与蔗糖相似，但热量比蔗糖低。木糖醇的年产量约为125,000吨，通过还原木糖生产。木糖是第二丰富的天然糖(仅次于葡萄糖)，因此它是一种有吸引力的原料。许多研究已经证明了使用木糖作为生物合成从生物燃料(乙醇)到化学品的多种产品的原料，包括乳酸、琥珀酸、木糖酸盐、1,2,4
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丁三醇和木糖醇。
[0006]木糖醇的工业化生产依赖于传统化学，而且该工艺几十年来一直保持相对不变。这种转化需要昂贵的催化剂，并且需要相对纯的木糖作为原料。已经努力寻找从较低成本的纤维素糖流(cellulosic sugar streams)中生产木糖醇的更经济的方法，包括开发生物合成工艺。生物合成生产具有降低成本、利用低质量原料、避免使用有机溶剂、消除对昂贵的还原催化剂的需求的潜力。然而，大多数以前从木糖生产木糖醇的生物合成研究依赖于需要额外的糖(通常是葡萄糖)作为电子供体的生物转化。葡萄糖的氧化(产生副产物葡萄糖酸)产生NAD(P)H，然后用于还原木糖。当仅仅考虑木糖时，虽然这些工艺提供了高木糖醇滴度和良好的产量，但是对与木糖等摩尔水平的葡萄糖的需求是非常低效的。
[0007]也许最简单的转化是木糖到木糖醇的转化，其只需要一种酶，木糖还原酶。木糖醇的生物合成生产，比起化学转化，具有降低成本的潜力，同时避免了使用有机溶剂，消除了对昂贵的还原催化剂的需要，并提高了产品纯度。

技术实现思路

[0008]我们合理地设计了经遗传修饰的微生物菌株，以利用两阶段动态代谢控制对从木糖生产木糖醇进行优化。如图1所示，该设计包括木糖还原酶的过表达和木糖异构酶(xylA)活性的动态降低，以降低与木糖醇的生产竞争的木糖代谢。为此目的，我们构建了菌株和质粒，使得能够通过基因沉默、XylA蛋白水解或两种功能的组合，动态诱导xyrA，并在磷酸盐(phosphate)耗竭或其他成因性事件(causative event)时动态降低XylA活性。本文提供了用于可规模化的生物发酵工艺的微生物菌株，其使用合成代谢阀(SMV)来将生长与产物形成解耦(decouple)。所描述的菌株提供了对代谢途径的动态控制，代谢途径包括当在某些可诱导条件下被改变时，对微生物生长具有负面影响的途径。
[0009]我们还充分描述了在工程化大肠杆菌中与木糖醇生物合成同时发生的NADPH通量的提高。木糖醇是通过NADPH依赖性还原酶由木糖产生的。我们利用两阶段动态代谢控制比较两种方法来优化木糖醇的生物合成，一种是化学计量法(stoichiometric approach)，其中竞争性通量降低，另一种是调节法，其中关键调节代谢物的水平降低。化学计量法和调节法分别导致木糖醇产量提高16倍和100倍。烯脂酰
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ACP还原酶和葡萄糖
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磷酸脱氢酶水平降低的菌株导致代谢物库(pool)改变，该改变导致了膜结合转氢酶和新的NADPH生成途径的激活，即丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶与NADPH依赖性铁氧还蛋白还原酶偶联，导致尽管NADPH库减少但NADPH通量增加。在仪器化的生物反应器中，这些菌株以86％的理论产率从木糖产生200g/L的木糖醇。对烯脂酰
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ACP还原酶和葡萄糖
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磷酸脱氢酶的动态控制将广泛地使依赖NADPH的生物转化得到提高。
[0010]本文还提供了用于木糖醇生产的多阶段生物工艺，其使用所描述的包含一个或多个合成代谢阀的经遗传修饰的微生物，所述合成代谢阀提供动态通量控制并导致木糖醇产量提高。在某些实施方案中，碳原料可以包括木糖，或者木糖与葡萄糖、木糖与阿拉伯糖、甘露糖、乳糖或者备选的二氧化碳、一氧化碳、甲烷、甲醇、甲醛或油的组合。可以向微生物中添加额外的遗传修饰，以提供木糖醇向另外的化学品或燃料产品的进一步转化。
[0011]通过研究以下附图和详细描述，其他方法、特征和/或优点将变得显而易见。所有这些另外的方法、特征和优点都包含在本说明书中，并受到所附权利要求的保护。附图简述
[0012]在权利要求中详细阐述了本专利技术的新颖特征。通过参照以下阐述使用了本专利技术的原理的说明性实施方案的详细描述以及附图，将获得对本专利技术的特征和优点的更好理解：
[0013]图1描绘了用于木糖醇生物生产的代谢阀的设计。在大肠杆菌中以NADPH为辅因子(粗箭头)由木糖还原酶(XyrA)生物合成木糖醇的过程。消耗木糖的主要竞争途径是通过木糖异构酶(XylA，阀)转化为木糖。
[0014]图2A
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图2C描绘了木糖还原酶的表达和酶动力学。图2A，使用SM10++(用于生长)和SM10
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No phos(用于表达)的培养基组合在BL21菌株中表达XyrA。表达结束后，通过冻
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融循环裂解生产后(postproduction)的细胞。接下来，由于XyrA上的His标签被设计到质粒序列中，所以通过N
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N树脂提取xyrA蛋白。图2B，以NADPH为辅因子时xyrA的活性。反应速度作为木糖浓度的函数作图。在这些试验中，NADPH保持在50μM的恒定初始水平。图2C，来自本项目和其他研究来源(作为比较)的XyrA的动力学参数。
[0015]图3描绘了在不同的xylA沉默和xylA蛋白水解组合下测得的木糖醇滴度/OD(g/L
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于从木糖生产木糖醇的经遗传修饰的微生物，其包括：木糖还原酶表达的可诱导性修饰和可诱导性合成代谢阀，所述可诱导性合成代谢阀包括：沉默基因表达的合成代谢阀，其特征在于沉默编码一种或多种酶的一种或多种基因的基因表达；或酶促降解合成代谢阀，其特征在于诱导一种或多种酶的酶促降解，或它们的组合。2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述木糖还原酶是NADPH依赖性木糖还原酶。3.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述木糖还原酶是黑曲霉(A.niger)的xyrA基因。4.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述经遗传修饰的微生物从木糖原料生产木糖醇。5.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中沉默基因的合成代谢阀或酶促降解合成代谢阀旨在控制编码木糖异构酶的基因或木糖异构酶。6.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中沉默基因的合成代谢阀或酶促降解合成代谢阀旨在控制编码葡萄糖
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磷酸脱氢酶(zwf)的基因或葡萄糖
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磷酸脱氢酶(zwf)。7.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中沉默基因的合成代谢阀或酶促降解合成代谢阀旨在控制至少两个基因，包括编码葡萄糖
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磷酸脱氢酶(zwf)的基因或所述葡萄糖
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磷酸脱氢酶(zwf)；和编码木糖异构酶的基因或木糖异构酶。8.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中沉默基因的合成代谢阀或酶促降解合成代谢阀旨在控制至少两个基因，包括编码葡萄糖
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磷酸脱氢酶(zwf)的基因或葡萄糖
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磷酸脱氢酶(zwf)；和编码烯脂酰
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ACP还原酶(fabI)的基因或烯脂酰
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ACP还原酶(fabI)。9.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中沉默基因的合成代谢阀或酶促降解合成代谢阀由以以下组成：沉默编码葡萄糖
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磷酸脱氢酶(zwf)的基因，和酶促降解葡萄糖
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磷酸脱氢酶(zwf)和烯脂酰
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ACP还原酶(fabI)。10.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中在多阶段生物发酵工艺的过渡阶段的条件下诱导木糖还原酶的表达、沉默基因表达的合成代谢阀和酶促降解合成代谢阀。11.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述诱导通过营养耗竭发生。12.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述诱导通过磷酸盐耗竭发生。13.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其进一步包含染色体缺失。14.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述基因表达的沉默包括CRISPR干扰，并且所述经遗传修饰的微生物还表达CASCADE向导阵列，所述阵列包括两个以上编码小向导RNA的基因，所述小向导RNA各自特异性地靶向不同的基因，以同时沉默多个基因。15.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中所述微生物在生物发酵过程中在
约24小时时产生大于20g/L的木糖醇产物滴度。16.一种多阶段发酵生物工艺，其用于由经遗传修饰的微生物生产木糖醇，其包括：(a)提供经遗传修饰的微生物，其包含：对木糖还原酶的表达的修饰和合成代谢阀，其包括：沉默基因表达的合成代谢阀，其特征在于沉默编码一种或多种酶的一种或多种基因的基因表达；或酶促降解...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔，
申请(专利权)人：杜克大学，
类型：发明
国别省市：