一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法技术

本发明专利技术属于病原菌防治技术领域，公开了一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法。本发明专利技术方法包含：将长牡蛎浸泡于含有浓度为5x104～5x105CFU/mL的经过灭活的溶藻弧菌的海水中进行免疫启动，并用免疫启动后的长牡蛎生产幼虫。本发明专利技术通过灭活的溶藻弧菌引发长牡蛎的先天免疫记忆，在被福尔马林灭活的溶藻弧菌引发免疫反应后，长牡蛎的DNA甲基化等表观遗传也随之发生变化，一方面为长牡蛎提供了二次接触溶藻弧菌后产生更快更强的免疫反应；另一方面将增强的弧菌抗性遗传给子代，并为子代提供广谱性的弧菌抗性。谱性的弧菌抗性。谱性的弧菌抗性。

【技术实现步骤摘要】
一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法


[0001]本专利技术涉及病原菌防治
，具体涉及一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法。

技术介绍

[0002]弧菌是一类广泛存在于海洋和河口流域的革兰氏阴性细菌，许多种类的弧菌已经被证实是水产养殖动物的重要病原菌。溶藻弧菌、哈维氏弧菌等严重威胁我国水产养殖行业，对鱼类、甲壳类、贝类等行业的发展造成了严重的危害。传统防治弧菌病的方法主要包括抗生素治疗、减活或者灭活疫苗、基因工程等。但是通过基因工程，例如中国专利CN102296044A，这一方法耗时耗力，成本高。抗生素治疗则可能造成严重的环境问题。因此减活或者灭活疫苗是一种比较简单理想的防治水产动物弧菌病的手段。
[0003]传统上的疫苗都是为具有适应性免疫的有颌鱼类制备的，例如：CN 114099657 A、CN 102283143 B。因此贝类、甲壳类等无脊椎动物不存在经典的适应性免疫，无法通过疫苗等方法提高对同一病原的抗性。而且，适用于有颌鱼类的疫苗往往只能针对单一弧菌进行预防，但由于海洋环境中致病性弧菌的多样应，这些疫苗很可能无法有效保护水产动物在海洋环境中免受其他种类弧菌的危害。除此之外，由于无脊椎动物相比于有颌鱼类有更小的体型，通过注射疫苗这一方式会及其繁琐，浪费大量的人力物力。
[0004]长牡蛎（Crassostrea gigas）是我国北方重要的贝类养植物种，但是近年来，长牡蛎夏季大规模死亡的报道时有出现，这对长牡蛎养殖行业造成了严重的威胁，导致了严重的经济损失。研究指出，弧菌是导致长牡蛎大规模死亡的重要因素，且存在多种对长牡蛎具有高毒力的弧菌。由于长牡蛎不存在经典的适应性免疫，因此被认为无法通过口服或注射疫苗的方式提高对弧菌的抗性。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]为解决
技术介绍
中的问题，本专利技术提供了一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法。
[0007]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法，包含：将长牡蛎浸泡于含有浓度为5x104～5x105CFU/mL的经过灭活的溶藻弧菌的海水中进行免疫启动，并用免疫启动后的长牡蛎生产幼虫。
[0008]优选的，使用福尔马林对溶藻弧菌进行灭活处理。
[0009]优选的，将长牡蛎浸泡于含有经过灭活的溶藻弧菌的海水中24～25小时，在生产幼虫前转移到过滤的海水中保持7天。
[0010]优选的，所述溶藻弧菌的灭活方法包含：将TCBS琼脂培养基上的溶藻弧菌挑到2216E培养基中进行扩增培养，除去多余的
培养基后，使用无菌海水重悬弧菌，重复3次，得到重悬菌液；向重悬菌液中加入福尔马林在4℃下培养24小时，得到细菌悬浮液，并离心、洗涤。
[0011]优选的，所述向重悬菌液中加入福尔马林前，将重悬菌液浓度调整为4x108～5x10
8 CFU/mL，加入的福尔马林的终浓度为1% （v/v）。
[0012]优选的，所述扩增培养温度为25℃、时间为6小时，转速为150 rpm。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次将灭活的弧菌作用于长牡蛎上，通过较低浓度（5x104～5x105CFU/mL）灭活的溶藻弧菌引发了长牡蛎的先天免疫记忆，在被福尔马林灭活的溶藻弧菌引发免疫反应后，长牡蛎的DNA甲基化等表观遗传也随之发生变化，一方面为长牡蛎提供了二次接触溶藻弧菌后产生更快更强的免疫反应，降低了长牡蛎被溶藻弧菌感染后的死亡率；另一方面将增强的弧菌抗性遗传给子代，并为子代提供广谱性的弧菌抗性。
附图说明
[0014]图1为实施例1中不同浓度的灭活溶藻弧菌对长牡蛎二次感染后长牡蛎的存活率；图2为实施例1中浓度为5x10
4 CFU/mL灭活的溶藻弧菌对长牡蛎子代弧菌抗性的影响。
具体实施方式
[0015]下面通过实施例及测试例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例和测试例只用于对本专利技术进行进一步说明，但本专利技术的内容不仅限于实施例中所涉及的内容，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本专利技术的内容做出一些非本质的改进和调整。
[0016]本专利技术实施方式提供了一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法，包含：将长牡蛎浸泡于含有浓度为5x104～5x105CFU/mL的经过灭活的溶藻弧菌的海水中进行免疫启动，并用免疫启动后的长牡蛎生产幼虫。
[0017]本专利技术区别于现有技术的关键在于从动物中普遍存在的先天免疫记忆出发，提出了一种保护长牡蛎等无脊椎动物免受弧菌威胁的新方法。这一关键点为不存在经典的适应性免疫的长牡蛎提供了一种可行提高长牡蛎及其子代弧菌抗性的方法。
[0018]本专利技术首次将灭活的弧菌作用于长牡蛎上，通过较低浓度（5x104～5x105CFU/mL）灭活的溶藻弧菌引发了长牡蛎的先天免疫记忆，在被灭活的溶藻弧菌引发免疫反应后，长牡蛎的DNA甲基化等表观遗传也随之发生变化。在长牡蛎二次接触溶藻弧菌后产生更快更强的免疫反应，降低了长牡蛎被溶藻弧菌感染后的死亡率；另一方面将增强的弧菌抗性遗传给子代，并为子代提供广谱性的弧菌抗性。
[0019]本申请中只能使用福尔马林对溶藻弧菌进行灭活处理。这是因为：常见的灭活或者减毒疫苗的制备方法包括使用天然无致病性菌株或者福尔马林灭活、热灭活。但目前尚未有无致病性溶藻弧菌的报道，因此无法使用天然无致病性溶藻弧菌作为疫苗。现有研究称热灭活会破坏溶藻弧菌抗原构象，降低其抗原性，并破坏细菌细胞膜，导致膜结合多糖的释放，不利于宿主特异性和持久性免疫的产生。但福尔马林灭活则不会出现上述问题。
[0020]本申请灭活处理的方法包含：将TCBS琼脂培养基上的溶藻弧菌挑到2216E培养基
中进行扩增培养，除去多余的培养基后，使用无菌海水重悬弧菌，重复3次，得到重悬菌液；向重悬菌液中加入福尔马林在4℃下培养24小时，得到细菌悬浮液，并离心、洗涤。
[0021]其中，所述向重悬菌液中加入福尔马林前，将重悬菌液浓度调整为4x108～5x10
8 CFU/mL，加入的福尔马林的终浓度为1% （v/v）。所述扩增培养温度为25℃、时间为6小时，转速为150 rpm。
[0022]将长牡蛎浸泡于含有经过灭活的溶藻弧菌的海水中24～25小时进行免疫启动，在生产幼虫前转移到过滤的海水中保持7天。
[0023]对于能够保护长牡蛎免受溶藻弧菌二次感染的适宜的免疫启动浓度的确定，是通过不同浓度灭活溶藻弧菌预处理长牡蛎，通过比较不同处理长牡蛎的在20天内的存活率确定适宜的免疫启动方法，存活率显著高于对照组（未经灭活溶藻弧菌预处理的长牡蛎）的被认为是适宜的浓度。
[0024]作为一些具体实施方式，本专利技术提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的具体方法包含以下步骤：（1）制备灭活溶藻弧菌：用接种环将TCBS琼脂培养基上的溶藻弧菌挑到2216E培养基中进行扩增培养（25℃，150 rpm，6小时）。离心（本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高长牡蛎及其幼虫弧菌抗性的方法，其特征在于，包含：将长牡蛎浸泡于含有浓度为5x104～5x105CFU/mL的经过灭活的溶藻弧菌的海水中进行免疫启动，并用免疫启动后的长牡蛎生产幼虫。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用福尔马林对溶藻弧菌进行灭活处理。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将长牡蛎浸泡于含有经过灭活的溶藻弧菌的海水中24～25小时，在生产幼虫前转移到过滤的海水中保持7天。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述溶藻弧菌的灭活方法包含：将TCBS琼脂培...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘士凯，汪贺冰，杨奔，鲁林基，支承钧，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：