生物支架和用于制备其的方法技术

提供了一种制备非重构型胶原蛋白基质的方法。方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
生物支架和用于制备其的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是申请日为2019年12月30号、申请号为201980087040.5、专利技术名称为“生物支架和用于制备其的方法”的分案申请。


[0003]本专利技术提供了生物支架和用于制备其的方法，该生物支架包括非重构型胶原蛋白基质和生物材料，和可选的组织粘合剂层。更具体地，该非重构型胶原蛋白基质和该生物支架可用作促进伤口愈合的敷料。

技术介绍

[0004]组织工程改造是指通过使用合成物质或生物活性物质的体外培养或构建的技术对器官和组织进行重构或修复。组织工程改造涉及诸如生物学、材料学和工程学等多学科，并且已经能够对诸如骨、软骨、皮肤、肾脏、肝脏、消化道、角膜、肌肉和乳房等组织进行重建。组织工程改造的基本方法也称为“再生医学”，包括以下步骤：首先，从人体取出细胞，并对细胞进行体外培养直至达到足够数量；然后，将细胞放置到人工支架中并使其生长；有时甚至需要添加一些化学物质或生物因子以促进细胞分化；最后将人工组织移植到患者。因此，组织再生的三个要素为细胞、生物支架和生长因子。
[0005]其中，构成人体最基本的结构和功能的单元是细胞。存在于细胞之间的是细胞外基质，该细胞外基质由细胞本身产生。其是包括结构性成分的物质，如蛋白质原纤维/束(如胶原蛋白)、结晶性无机矿物等。
[0006]组织由许多具有相似形态和功能的细胞组成，并通过细胞外基质结合在一起。其中，根据不同的细胞类型，它们被分为不同的组织，例如上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织等。其中，结缔组织由大量的细胞外基质与散布在其中的细胞组成。细胞外基质含有基质、原纤维和组织液等。胶原蛋白是动物结缔组织中最重要的结构性蛋白质，也是细胞外基质中最重要的成分。在动物结缔组织中，除了60
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70％的水分之外，还包含20
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30％的胶原蛋白。因此，胶原蛋白是广泛存在于动物体内的蛋白质，结缔组织广泛分布于人体内并且存在于几乎所有器官。
[0007]胶原蛋白主要以不溶性原纤维的形式存在，约占人体组织中蛋白质的33％。换言之，胶原蛋白占人体中蛋白质的三分之一，并且是结缔组织中非常重要的结构性蛋白质。它发挥“床垫”及“水泥”的作用，保护并连接各组织以支撑人体结构。因此，通常将胶原蛋白用作生物假体的材料。
[0008]胶原蛋白的最基本单元是原胶原蛋白，其是由三条多肽链组成的分子。三条多肽链通过链间氢键平行紧密结合在一起以形成稳定的三螺旋结构。三螺旋链的胶原蛋白单元被称为原胶原蛋白，直径为约1.5nm，长度为约280nm。生理状态下，多个原胶原蛋白分子自聚集成胶原蛋白微原纤维结构，每个分子以约67nm的距离交错排列。然后可以将微原纤维聚集成通常为约50nm的不同直径的原纤维。在体内，原纤维堆叠成不同的四级结构，其可以
形成网状原纤维，如表皮细胞下的基质。这些原纤维可以进一步聚集成纤维，如韧带和肌腱，其含有沿单一方向规则排列的胶原蛋白原纤维。
[0009]目前为止，已发现的动物胶原蛋白可以分为至少28种。除了主要为II型胶原蛋白的透明软骨，大部分的结缔组织主要含有I型胶原蛋白，占胶原蛋白总含量的约90％，并且还是使用最广泛的胶原蛋白生物材料。它的主要结构性蛋白质为结缔组织提供结缔组织所需的支撑、保护和各种机械性能，如张力、拉力、强度和粘弹性等。在生物化学性能方面，它可以促进凝血级联并催化血块的形成。胶原蛋白的功能包括控制分子渗透性、促进伤口愈合与组织修复、和调控细胞与组织的生理功能。
[0010]用于制备常规胶原蛋白基质的方法，例如中国台湾地区专利第476642号中的用于制备多孔胶原蛋白基质的方法，是在30
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45℃以近似生理条件重构胶原蛋白基质。通过冷冻和冻干该基质可以获得多孔胶原蛋白基质。图3示出了常规多孔胶原蛋白基质的100
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方法电子显微照片。其外观具有呈现出松散且不规则的薄片状外观的结构，并且无法提供较好的张力和抗细胞收缩性，二者是优化合适细胞迁移和增殖所需要的。此外，由于胶原蛋白的表面特性，不利于细胞进入。
[0011]美国专利第5,997,895号中的另一常规技术“使用胶原蛋白基质的硬脑膜/脑膜修复产品”提供了用于修复并促进脑膜生长的方法。可以使用不含致病病毒残留物的经证实生物相容性来源的胶原蛋白。交联反应被用于胶原蛋白基质并且以10
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500μm的多孔直径形成多孔胶原蛋白结构，其使得受损脑膜得以修复并促进脑膜的生长。然而，由于胶原蛋白取自动物皮肤(例如猪皮等)的真皮层，因此当在处理猪皮的过程中未完全去除毛囊时，会破坏后续制备胶原蛋白基质的整体结构。还会影响制备的胶原蛋白的纯度，这会引起细菌感染和免疫反应，或者在临床使用中造成免疫排斥。
[0012]标题为“高纯度胶原蛋白的制备”的中国台湾地区专利第098125217号提供了用于胶原蛋白制备的方法，包括：提供表面积为20mm2至2m2的结缔组织；使用第一酸溶液以使结缔组织的体积膨胀至少50％而形成膨胀的结缔组织，其中酸溶液的pH值是1
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6并且酸溶液基本上不含盐；清洗膨胀的结缔组织以去除非胶原蛋白性物质而形成胶原蛋白基质；然后使用提取溶液从胶原蛋白基质提取胶原蛋白而制备含有胶原蛋白的溶液。在上述技术中，溶液是胶原蛋白，通过常规方法形成的多孔胶原蛋白基质无法提供较好的张力和抗细胞收缩性，二者是优化合适细胞浸润和增殖所需要的。
[0013]标题为“非细胞性真皮基质及其用于移植的使用方法”的另一美国专利技术专利公告第US8067149B2号提供了用于提取非细胞性组织基质的方法，该方法包括去除毛囊和用表面活性剂SDS提取。然而其提取非细胞性组织基质，这不同于本专利技术的高纯度多孔胶原蛋白。
[0014]生物支架的当前总体状况如下。
[0015]目前，市场上大多数生物支架由重构型胶原蛋白基质制成，并且其相关产品已在多个以前的专利中公开。例如，在美国专利第4,193,813号中，先将胶原蛋白溶解在醋酸中，用戊二醛交联，然后在低温下冷冻持续较长时间(例如20小时)。解冻后，以机械方式去除水而形成海绵样基质，并且通过此方法获得的基质的孔径为约80
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1400μm。美国专利第4,412,947号教导的方法包括将高纯度不可溶胶原蛋白颗粒悬浮在醋酸溶液中，以约每分钟0.3至0.4℃的冷却速率冷冻至
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65℃，并冻干以形成多孔片状基底。美国专利第4,522,753号教导
了将胶原蛋白和硫酸软骨素混合成共聚物，通过戊二醛交联，并冻干以得到孔径为约20至180μm的多孔基质，可以将其用作人工皮肤基底。美国专利第4,970,298号公开了可以通过碳二亚胺和脱水热法使含有酸可溶性胶原蛋白溶液或者酸可溶性胶原蛋白、透明质酸和纤连蛋白等的溶液的混合物溶液交联。在不同温度下冷冻后，采用冻干以制备多孔基质。冷冻温度为
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30至
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50℃，得到的基质的孔径本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备非重构型胶原蛋白基质的方法，包括：从动物皮肤组织获得真皮层片；执行脱毛步骤，所述脱毛步骤包括将所述真皮层片浸入高离子强度盐溶液，然后向所述盐溶液添加蛋白水解酶，由此产生脱毛的真皮层片；执行膨润步骤，所述膨润步骤包括将所述脱毛的真皮层片浸入第一酸性溶液足够时间段以使所述脱毛的真皮层片形成膨润的真皮片层，由此形成所述非重构型胶原蛋白基质，所述非重构型胶原蛋白基质具有多个交织重叠的束状胶原蛋白原纤维和由所述束状胶原蛋白原纤维形成的多个孔；和执行去抗原步骤，所述去抗原步骤包括将所述非重构型胶原蛋白基质浸入含有胃蛋白酶的第二酸性溶液。2.如权利要求1所述的方法，其中所述盐溶液的离子强度大于0.15N，优选地所述离子强度在0.5N至10N之间。3.如权利要求1所述的方法，其中所述盐溶液是含有氯化钠、硫酸铵或其混合物的磷酸盐溶液。4.如权利要求1所述的方法，其中含有所述盐溶液是含有氯化钠的磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：黃玲惠，
申请(专利权)人：黄玲惠，
类型：发明
国别省市：