一种可视化即时检测微流控芯片及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种可视化即时检测微流控芯片及其检测方法，属于微流控芯片制造技术和基因诊断领域；本发明专利技术所述可视化即时检测稻曲病菌核酸的微流控芯片集孢子收集、孢子核酸快速释放、扩增及可视化检测等功能为一体；所述微流控芯片结构简单，其检测方法具有快速、无需大型仪器的特点，能够实现对各类真菌孢子尤其是稻曲病孢子的快速检测。其是稻曲病孢子的快速检测。其是稻曲病孢子的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种可视化即时检测微流控芯片及其检测方法


[0001]本专利技术属于微流控芯片制造技术和基因诊断领域，具体涉及一种可视化即时检测微流控芯片及其检测方法。

技术介绍

[0002]水稻是是世界重要的粮食作物，水稻的高产和稳产对于中国乃至全世界的粮食生产安全都有着举足轻重的作用。但是近年来，由于杂交水稻大面积推广和稻田肥水水平提高，稻曲病由历史上的次要病害演变为当前水稻生产上“新三大病害”之一。稻曲病菌可产生子囊孢子、厚垣孢子和薄壁分生孢子。其中，稻曲病孢子以厚垣孢子萌发的分生孢子为主要侵染源，通过气体传播，且传播速度很快。随着
‘
甬优12
’
为代表的甬优系列籼粳交超级稻的大面积推广和应用，稻曲病发病加重，严重时可造成20％～30％的产量损失。稻曲病不仅严重影响水稻的产量和品质，稻曲病菌产生的毒素Ustiloxins，也对人、动物、植物的细胞分裂有强烈的抑制作用，食用后可引起人畜腹泻、早产、甚至流产等中毒现象，甚至死亡，这对稻米的食用安全带来严重的威胁。
[0003]迄今为止，以气传孢子为媒介的稻曲病检测方法主要有液相色谱法、流式细胞法、形态学显微图像识别法、以及分子生物学法等。前两种方法的准确度较高，但是实验步骤较为复杂。为了能够实现稻曲病的快速检测，国内外展开了广泛研究，其中，显微图像识别法通过对捕捉到的孢子形状及纹理进行特征学习与比对，从而实现快速检测，应用最为广泛。但是空气中的复杂颗粒多，且稻曲病孢子和多数霉菌孢子的尺寸都在3～8微米，形态表征均为圆形，这直接导致常规显微图像法无法有效区分，所以显微图像识别法的准确率较低。以聚合酶链式反应(PCR)为代表的分子生物学方法被广泛应用于稻曲病孢子检测，但是因其需要特定的实验室检测及专业人员操作，且实验流程繁琐，不适合对稻曲病进行即时检测。环介导等温扩增(LAMP)不仅具有很高的灵敏度和特异性，而且还可以使用羟基萘酚蓝(HNB)、钙黄绿素和SYBR Green I等染料进行可视化检测。LAMP反应不需要复杂的热循环系统，更适合小型化仪器。但是这种方法预处理样本费时费力，对试剂的需求量较大，且开盖操作会增大假阳性率，难以直接满足即时检测的需要。
[0004]随着微流控技术的发展，利用微流体动力学技术实现液体中微颗粒的分离、富集理论已日趋成熟。但是，微尺度液流属性与气流有较大不同，气传孢子等微颗粒的分离富集机理尚不清晰。且稻曲病孢子需要通过破壁提取DNA，效率低下且限制了即时检测的实际操作。因此，亟需建立一种快速而准确的稻曲病孢子的检测方法。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的一些不足，本专利技术提供了一种可视化即时检测微流控芯片及其检测方法；本专利技术所述可视化即时检测稻曲病菌核酸的微流控芯片集孢子收集、孢子核酸快速释放、扩增及可视化检测等功能为一体；所述微流控芯片结构简单，其检测方法具有快速、无需大型仪器的特点，能够实现对各类真菌孢子尤其是稻曲病孢子的快速检测。
[0006]本专利技术是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
[0007]本专利技术中首先提供了一种可视化即时检测微流控芯片，所述微流控芯片包括上层基片和与上层基片键合的下层底片；
[0008]所述上层基片中设有孢子纯化区、孢子裂解区、核酸稀释区和可视化检测区；
[0009]所述孢子纯化区包括样本入口、第一大颗粒分离区、第二大颗粒分离区和收集区；所述样本入口、第一大颗粒分离区、第二大颗粒分离区和收集区之间依次通过第一通道、第二通道和收缩
‑
膨胀通道连通；
[0010]所述孢子裂解区包括裂解池和设在裂解池上的裂解试剂入口；
[0011]所述核酸稀释区包括稀释池和设在稀释池上的稀释试剂入口；
[0012]所述可视化检测区设有阴性对照区和阳性检测区，所述阳性检测区包括第一检测池和设在其上第一反应试剂入口，所述阴性对照区包括第二检测池和设在其上第二反应试剂入口；所述阴性对照区和阳性检测区之间通过微流控通道连通；
[0013]所述孢子纯化区、孢子裂解区、核酸稀释区和可视化检测区之间依次设有相连接的微流控通道。
[0014]进一步地，孢子纯化区、孢子裂解区、核酸稀释区、阴性对照区和阳性检测区之间的微流控通道上分别设有控制流体的第一微阀、第二微阀、第三微阀和第四微阀。
[0015]进一步地，所述第一微阀、第二微阀、第三微阀和第四微阀包括手动微阀，所述手动微阀通过在微流控通道上打孔，孔中塞入软塞得到，所述软塞的材质是硅胶。
[0016]进一步地，孢子纯化区上还设有与收集区连接的缓冲试剂入口。
[0017]进一步地，所述可视化检测区中，阴性对照区和阳性检测区对称布置。
[0018]进一步地，所述样本入口、缓冲试剂入口、裂解试剂入口、稀释试剂入口、第一反应试剂入口和第二反应试剂入口处均设置封堵膜优选地，所述封堵膜为PVDC(聚偏二氯乙烯)膜。
[0019]进一步地，所述上层基片的材质为PDMS(聚二甲基硅氧烷)，所述下层底片的材质为玻璃硅片。
[0020]本专利技术中还提供了上述可视化即时检测微流控芯片的制备方法，具体包括：
[0021](1)使用显影剂显影附有微流控通道图案的感光干膜，得到微流控芯片掩膜；
[0022](2)将铸膜溶液浇在步骤(1)制得的微流控芯片掩膜上，并用镂空的PMMA(有机玻璃)板固定。
[0023](3)将真空泵抽取铸膜溶液中的气泡，并将其放置于干燥箱中静置，得到具有微流控通道结构的上层基片。
[0024](4)采用打孔器将区域之间的微通道打孔，以实现流体控制；
[0025](5)等离子机键合由步骤(3)获得的上层基片以及键合时用到的下层基片，将上层基片和下层底片放置在加热台上加热，进行进一步键合。
[0026]进一步地，步骤(3)中，所述真空泵抽取铸膜溶液中的气泡的时间为30min～1h；所述静置时间为3～3.5h。
[0027]进一步地，步骤(5)中，所述加热的时间为20min
‑
30min。
[0028]本专利技术中还提供了上述微流控芯片在真菌孢子可视化检测中的应用，具体的所述真菌孢子包括稻曲病孢子。
[0029]本专利技术中还提供了一种微流控芯片可视化检测真菌孢子的方法，所述方法包括如下步骤：
[0030](1)孢子收集：
[0031]将含有真菌孢子的水溶液置于气溶胶发生器中，依次通过真空泵、控制流量的转子流量计与微流控芯片相连接，在微流控芯片的孢子纯化区获得目标孢子；
[0032](2)孢子的核酸提取：
[0033]将缓冲液从微流控芯片的缓冲试剂入口处加入到收集区，并与收集区的孢子混合，然后开启第一微阀，将缓冲液引入孢子裂解区，将裂解液通过裂解试剂入口加入到孢子裂解区，然后关闭第一微阀与第二微阀，将微流控芯片加热处理，加热完成后得到裂解后的粗组织液；
[0034]接着打开第二微阀，并将所述裂解后的粗组织液引入到核酸稀释本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可视化即时检测微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括上层基片(1)和与上层基片(1)键合的下层底片(2)；所述上层基片(1)中设有孢子纯化区(3)、孢子裂解区(4)、核酸稀释区(5)和可视化检测区(6)；所述孢子纯化区(3)包括样本入口(31)、第一大颗粒分离区(32)、第二大颗粒分离区(33)和收集区(34)；所述样本入口(31)、第一大颗粒分离区(32)、第二大颗粒分离区(33)和收集区之间依次通过第一通道、第二通道和收缩
‑
膨胀通道连通；所述孢子裂解区(4)包括裂解池(42)和设在裂解池(42)上的裂解试剂入口(41)；所述核酸稀释区(5)包括稀释池(52)和设在稀释池(52)上的稀释试剂入口(51)；所述可视化检测区(6)设有阴性对照区和阳性检测区，所述阳性检测区包括第一检测池(62)和设在其上第一反应试剂入口(61)，所述阴性对照区包括第二检测池(64)和设在其上第二反应试剂入口(63)；所述阴性对照区和阳性检测区之间通过微流控通道(7)连通；所述孢子纯化区(3)、孢子裂解区(4)、核酸稀释区(5)和可视化检测区(6)之间依次设有相连接的微流控通道。2.根据权利要求1所述的可视化即时检测微流控芯片，其特征在于，孢子纯化区(3)和孢子裂解区(4)之间、孢子裂解区(4)和核酸稀释区(5)之间、核酸稀释区(5)和可视化检测区(6)之间的微流控通道上分别设有控制流体的第一微阀(7)、第二微阀(8)、第三微阀(9)；所述可视化检测区(6)中阴性对照区和阳性检测区之间的微流控通道上设有控制流体的第四微阀(10)。3.根据权利要求2所述的可视化即时检测微流控芯片，其特征在于，所述第一微阀(7)、第二微阀(8)、第三微阀(9)和第四微阀(10)包括手动微阀，所述手动微阀通过在微流控通道(7)上打孔，孔中塞入软塞得到，所述软塞的材质是硅胶。4.根据权利要求1所述的可视化即时检测微流控芯片，其特征在于，所述可视化检测区(6)中，阴性对照区和阳性检测区对称布置。5.根据权利要求1所述的可视化即时检测微流控芯片，其特征在于，所述孢子纯化区(3)上还设有与...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宗保，祁嘉昊，杨宁，刘淑华，王爱英，唐健，汪慈林，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：