一种新型内毒素去除磁珠的制备方法技术

本发明专利技术涉及生物制品技术领域，尤其涉及一种新型内毒素去除磁珠的制备方法。通过将C因子N端的三个Sushi区进行重组表达后偶联至聚合物磁性微球上，具体包括：S1、C因子Sushi123亚克隆设计，S2、Sushi123的表达和生物素修饰，S3、Sushi123的表达和纯化，S4、Sushi123蛋白和偶联介质偶联，S5、内毒素去除磁珠去除蛋白内毒素。该方法去除步骤简单，只需要将内毒素去除磁珠清洗后直接加入样品进行混合孵育30

【技术实现步骤摘要】
一种新型内毒素去除磁珠的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种内毒素结合配体，尤其涉及一种新型内毒素去除磁珠的制备方法。

技术介绍

[0002]内毒素脂多糖分子由菌体特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A三部分构成。脂质A是内毒素的主要毒性组分。类脂A中含有多个磷酸根结构，因而具有较低的等电点(pI＝3.1)，因此当溶液的pH大于3.1，内毒素带有负电荷，类脂A的分子结构由氨基葡萄糖、磷酸根、10
‑
18碳的长链脂肪酸组成，结构图见图1。
[0003]各种细菌内毒素的毒性作用大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。内毒素注射到机体内虽可产生一定量抗体，但这种抗体抵消内毒素毒性的作用很微弱。以下总结了一些内毒素的生物学功能：
[0004](1)致热性；
[0005](2)对细菌细胞外膜有保护作用；
[0006](3)诱导白细胞粘连分子粘连到内皮细胞上；
[0007](4)刺激中性粒细胞，诱导其形态发生改变；
[0008](5)促发凝血系统，导致弥散性血管内凝血；
[0009](6)导致器官损伤，中毒性休克；
[0010](7)诱导细胞凋亡；
[0011](8)具有免疫佐剂活性；
[0012](9)激活补体，发挥天然的免疫应答效应。
[0013]为此，如何有效去除内毒素？内毒素分子结构复杂且不均一，导致内毒素可以多种方式与溶液中的蛋白质相互作用，形成复合物，大大增加了去除的难度。内毒素的去除可采用亲合层析法、离子交换层析法、疏水层析法、分子筛层析法、超滤法、吸附法和亲和色谱等，见下表1。
[0014]表1：
[0015][0016][0017]现内毒素去除方式或者产品无论是通过PMB亲和填料或者Q柱等离子填料来清除内毒素，都存在样品回收率低、操作复杂以及内毒素残留较多的现象；另一方面在抗体药以及CART等热门领域的冲击下，相关部门对产品内毒素的要求越来越高，相关新产品的上市也越发的艰难。
[0018]市场上内毒素去除试剂产品较多，原理上大致有以下几种：第一种是阴离子交换去除内毒素，由于内毒素主要的成分类脂A中含有多个磷酸根结构，因而具有较低的等电点，在pH＞3.1的缓冲液中内毒素带有很强的负电荷，所以阴离子交换柱可以很容易的吸附
内毒素；另一种是利用PMB做为配体进行内毒素的去除，PMB和内毒素的结合现在通常认为是既有离子性的相互作用，又有疏水性的相互作用，另外曲拉通、活性炭等都能够进行内毒素去除。但是以上方法都存在一些问题，如处理后样品中的内毒素残留仍然很严重，没有去除的很干净；或者去除后的样品回收率极低，样品损失严重；再或者内毒素去除步骤较为复杂，对操作者要求很高等。

技术实现思路

[0019]本专利技术旨在解决上述缺陷，目的在于解决和弥补市场内毒素去除方式的缺陷和不足，通过一种简单、快速的方式将样品中的内毒素去除到很低的水平，完全能够满足科研、抗体药、细胞治疗等领域的研究，提供一种新型内毒素去除磁珠的制备方法。
[0020]为了克服
技术介绍
中存在的缺陷，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：这种新型内毒素去除磁珠的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
[0021]S1、C因子Sushi123亚克隆设计：选用东方鲎的C因子进行序列设计和构建亚克隆质粒，在序列设计过程中带有His tag和Avi tag，His tag用于纯化，Avi tag便于生物素标记，合成后在真核表达系统生产Sushi123重组蛋白，目的基因经软件分析后进行密码子优化，构建至真核表达载体上；
[0022]S2、Sushi123的表达和生物素修饰：通过共转BirA酶表达质粒和Sushi123表达质粒，将生物素定向标记至Sushi123上的Avi tag上，BirA酶表达质粒和Sushi123表达质粒所使用的比值是1：4
‑
1：9；
[0023]S3、Sushi123的表达和纯化：Sushi123蛋白融合了8
×
His
‑
taq，通过高耐受的Ni填料进行亲和纯化，上样前用0.1M NaOH冲洗30min，随后先上样后平衡，平衡结束后进行2
‑
5mM低浓度咪唑洗杂，再通过250
‑
500mM高浓度咪唑洗脱，最后透析换液至0.01M PBS中，pH＝7.4；
[0024]S4、Sushi123蛋白和偶联介质偶联：
[0025]S5、内毒素去除磁珠去除蛋白内毒素：
[0026]a、使用前上下颠倒混匀内毒素去除磁珠，用无热源枪头吸取所需体积的内毒素去除磁珠，放在磁力架上，待磁珠全部吸附至管壁后去除保护液，加入5倍磁珠体积的0.01M PBS，pH＝7.4重悬磁珠，上下颠倒混匀几次后利用磁力架去除0.01M PBS，pH＝7.4；
[0027]b、如此反复清洗3
‑
5次后加入待测样品，用样本重悬内毒素去除磁珠，4℃或者常温摇晃孵育30min
‑
60min，最后将样品和内毒素去除磁珠的混合物放置于磁力架上，缓慢吸取样品进行后续检测。
[0028]根据本专利技术的另一个实施例，进一步包括所述步骤S4中偶联介质选用活化后的微球，微球为不带有磁性的白球或者是带有磁性的磁珠或者是琼脂糖微球或者是聚合物微球。
[0029]根据本专利技术的另一个实施例，进一步包括所述步骤S4中偶联介质选用SA聚合物磁珠，SA聚合物磁珠浓度为10mg/ml，具体步骤为：
[0030]a、将SA聚合物磁珠混匀后，用移液枪准确吸取1ml至无热源1.5ml EP管内；
[0031]b、利用磁力架，去除保护液，用去内毒素水清洗三次，1mll/次，再用0.5M NaOH清洗三次，1ml/次，最后用1
×
PBS无内毒素的水配置清洗五次，1ml/次，所有操作在生物安全
柜中进行；
[0032]c、加入0.5mg Sushi123重组蛋白，封口膜封口，放旋转仪上25℃反应40min；
[0033]d、收集反应后的蛋白测试反应后的浓度，并电泳看结合情况，电泳条件如下：
[0034]上样2μg Sushi123重组蛋白，4
‑
20％的SDS
‑
PAGE梯度胶采用MOPS缓冲液进行电泳，设置参数为160V电泳40min，最后进行考马斯亮蓝染色进行蛋白大小和纯度；
[0035]e、用1
×
PBS无内毒素的水配置清洗三次，每次1ml，最终定体积至10mg/ml。
[0036]本专利技术的有益效果是：本专利技术通过重组表达平台得到了C因子的内毒素结合片段Sushi123蛋白，该蛋白通过定点标记的方法进行了生物素的标记，并通过高耐受的Ni柱进行了无内毒素纯化，将该蛋白定偶联至SA磁珠得到了具有内毒素去除功能的磁珠。该磁珠的特点是：
[0037]1)可以将样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型内毒素去除磁珠的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：S1、C因子Sushi123亚克隆设计：选用东方鲎的C因子进行序列设计和构建亚克隆质粒，在序列设计过程中带有His tag和Avi tag，His tag用于纯化，Avi tag便于生物素标记，合成后在真核表达系统生产Sushi123重组蛋白，目的基因经软件分析后进行密码子优化，构建至真核表达载体上；S2、Sushi123的表达和生物素修饰：通过共转BirA酶表达质粒和Sushi123表达质粒，将生物素定向标记至Sushi123上的Avi tag上，BirA酶表达质粒和Sushi123表达质粒所使用的比值是1：4
‑
1：9；S3、Sushi123的表达和纯化：Sushi123蛋白融合了8
×
His
‑
taq，通过高耐受的Ni填料进行亲和纯化，上样前用0.1M NaOH冲洗30min，随后先上样后平衡，平衡结束后进行2
‑
5mM低浓度咪唑洗杂，再通过250
‑
500mM高浓度咪唑洗脱，最后透析换液至0.01M PBS中，pH＝7.4；S4、Sushi123蛋白和偶联介质偶联：S5、内毒素去除磁珠去除蛋白内毒素：a、使用前上下颠倒混匀内毒素去除磁珠，用无热源枪头吸取所需体积的内毒素去除磁珠，放在磁力架上，待磁珠全部吸附至管壁后去除保护液，加入5倍磁珠体积的0.01M PBS，pH＝7.4重悬磁珠，上下颠倒混匀几次后利用磁力架去除0.01M PBS，pH＝7.4；b、如...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹阳，单玉飞，方利，
申请(专利权)人：常州鸿蒙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：