冠状病毒疫苗组合物及其使用方法技术

本公开提供了组合物，例如包含活的减毒的冠状病毒的疫苗组合物。本公开还提供了使用冠状病毒疫苗的方法，包括治疗和/或预防冠状病毒感染的方法，并提供了制备冠状病毒疫苗的方法。法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】冠状病毒疫苗组合物及其使用方法
[0001]关于联邦资助研究的声明本专利技术是在政府支持下根据NIH授予的拨款号AI085089以及USDA ARS的协议58
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075、59
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003和58
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042完成的。政府在本专利技术中具有某些权利。
[0002]通过引用电子提交的材料并入作为本公开的一部分的序列表与说明书同时作为文本文件提交。含有序列表的文本文件的名称为“55120_Seqlisting.txt”，其创建于2021年3月19日，且大小为96,941字节。序列表的主题通过引用以其整体并入本文。
[0003]背景在2019年严重急性呼吸道冠状病毒2 (SARS
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CoV
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2，引起COVID
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19的病毒)的出现以及人类感染迅速的全球传播突出了对于开发治疗剂和疫苗以限制冠状病毒流行的需求(Wu F, 等人, 2020, Nature 1
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8; Zhou P, 等人, 2020, Nature 1
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4; 和Zhu N, 等人, 2020, N Engl J Med NEJMoa2001017)。猪流行性腹泻病毒(PEDV)于2013年在美国突然出现，引起猪群的巨大损失，并且也属于巢病毒目(Nidovirales)中的冠状病毒科(Coronaviridae)。该病毒科(CoV)都具有大的正义RNA基因组(约30kb)，其由核衣壳(N)蛋白包裹，并由称为包膜(E)、膜(M)和刺突(S)的病毒结构蛋白修饰的宿主膜包膜。当通过电子显微镜观察时，刺突蛋白给予病毒典型的冠状外观(Zhou P, 等人, 2020, Nature 1
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4)。刺突蛋白接合宿主受体并介导病毒和宿主膜的融合，使病毒基因组RNA进入细胞的细胞质。CoV基因组RNA被翻译以生成大的多蛋白，所述多蛋白被加工成15或16个非结构蛋白(Nsp或nsp)，其组装在一起以形成病毒复制复合物。最初提出这些Nsp仅在病毒RNA的复制和转录中发挥功能。然而，近来的研究揭示，这些蛋白中的许多是多功能的，并且通过充当宿主I型和III型干扰素(IFN)应答的拮抗剂在限制宿主对病毒感染的应答中发挥重要作用[综述于(Kindler E, 和Thiel V., 2014, Curr Opin Microbiol 20:69
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75)。I型IFN (IFN
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α和IFN
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β)和III型IFN (IFN
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λ)以自分泌和旁分泌方式起作用，以通过表达限制冠状病毒复制的干扰素刺激基因(ISG)来诱导抗病毒状态(Mesev E V, 等人, 2019, Nat Microbiol 4:914
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924)。来自Chanapanavar和合作者的研究记录，这种病毒介导的感染期间宿主干扰素应答的延迟促成更严重的疾病(Channappanavar R, 等人, 2016, Cell Host Microbe 19:181
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193; 和Channappanavar R, 等人, 2019, J Clin Invest 129)。
[0004]研究者正在开发和测试使冠状病毒干扰素拮抗剂失活以减少病毒发病机制并生成候选的活的减毒的病毒疫苗的策略(Deng X, 等人, 2017, Proc Natl Acad Sci U S A 114:E4251
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E4260; Deng X, 等人, 2019, J Virol 93:e02000
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18; Menachery VD, 等人, 2017, mSphere 2:e00346
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17; Menachery VD, 等人, 2018, J Virol 92:e00710
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18; 和Hou Y, 等人, 2019, J Virol 93:e00406
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19)。Menachery和合作者显示，使Nsp16中高度保守的CoV 2'
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O
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甲基转移酶(MTase)酶失活，导致病毒活化宿主干扰素应答，在动物中减弱，并引发对中东呼吸道综合征(MERS) CoV的保护性免疫应答(Menachery VD, 等人, 2017, mSphere 2:e00346
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17)。Hou和合作者显示，失活Nsp16与PEDV
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22A毒株中刺突糖蛋白的缺失的组合，生成表现出降低的发病机制、但仍引起仔猪中的腹泻的病毒(HouY等
人, 2019, J Virol 93:e00406
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19)。
[0005]在2017年，评估高度保守的复制酶干扰素拮抗剂(Nsp15内含有的核糖核酸内切酶(EndoU))的作用。研究EndoU作为毒力因子的基本原理源于使用鼠冠状病毒——小鼠肝炎病毒(MHV)获得的有希望的结果。生成在EndoU的催化组氨酸残基中具有突变的MHV，并且发现这种病毒与野生型病毒一样好地在干扰素无应答细胞中复制，揭示EndoU活性不是CoV复制所需的。EndoU
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突变鼠冠状病毒在干扰素应答性巨噬细胞中引发稳健的I型干扰素应答，未引起临床疾病，并在小鼠中引发保护性免疫应答(Deng X, 等人, 2017, Proc Natl Acad Sci U S A 114:E4251
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E4260)。这些结果记录了EndoU活性在鼠冠状病毒的发病机制中的关键作用。为了确定EndoU活性是否在其他CoV中作为毒力因子发挥作用，使用PEDV进行研究。发现失活PEDV中的EndoU/Nsp15足以引发来自感染细胞的I型和III型干扰素应答，并减少感染仔猪中的临床疾病(Deng X, 等人, 2019, J Virol 93:e02000
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18)。然而，这种单一干扰素拮抗剂的失活不足以使PEDV完全减毒，因为受感染的仔猪仍然表现出一些腹泻(Deng X, 等人, 2019, J Virol 93:e02000
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18)。此外，显示PEDV Nsp1 (F44A)突变降低Nsp1在培养细胞中的过表达系统中拮抗干扰素活化的能力(Zhang Q, 等人, 2018, J Virol 92:e01677
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17; 和Zhang Q, Shi K, Yoo D, 2016, Virology 489:252
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268)，但这种突变在病毒复制背景下的影响是未知的。
[0006]目前，不清楚在肠道感染的背景下使多种CoV拮抗剂失活是否会影响疾病和宿主对感染的免疫应答。
[0007]专利技术概述在各个方面，本公开提供了冠状病毒、组合物(包括疫苗组合物)、制备和使用所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.包含冠状病毒的疫苗组合物，所述冠状病毒在至少两种非结构蛋白中包含至少一个突变，其中所述疫苗组合物能够在受试者中诱导免疫应答。2.权利要求1的疫苗组合物，其中所述冠状病毒在三种非结构蛋白各自中包含至少一个突变。3.权利要求1的疫苗组合物，其中所述冠状病毒包含第一非结构蛋白中的至少一个突变、第二非结构蛋白中的至少一个突变和第三非结构蛋白中的至少两个突变。4.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述非结构蛋白中的至少两种是干扰素拮抗剂。5.权利要求4的疫苗组合物，其中所述冠状病毒包含第一非结构蛋白中的至少一个突变、第二非结构蛋白中的至少一个突变和第三非结构蛋白中的至少两个突变，其中每种非结构蛋白是干扰素拮抗剂。6.权利要求4或权利要求5的疫苗组合物，其中至少两个突变位于所述至少两种非结构蛋白各自的催化位点中。7.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述非结构蛋白选自Nsp1、Nsp15和Nsp16。8.权利要求7的疫苗组合物，其中所述冠状病毒包含Nsp1中的一个突变、Nsp15中的两个突变和Nsp16中的一个突变。9.权利要求8的疫苗组合物，其中Nsp15中的所述两个突变和Nsp16中的所述一个突变位于Nsp15和Nsp16的催化位点中。10.权利要求9的疫苗组合物，其中突变Nsp1是苯丙氨酸至丙氨酸取代，Nsp15突变都是组氨酸至丙氨酸取代，且Nsp16突变是天冬氨酸至丙氨酸取代。12.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述冠状病毒选自严重急性呼吸综合征冠状病毒
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2(SARS
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CoV
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2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS
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CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS
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CoV)、人冠状病毒229E(HCoV
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229E)、人冠状病毒0C43(HCoV
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0C43)、人冠状病毒HKU1(HCoV
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HKU1)、人冠状病毒NL63(HCoV
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NL63)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、犬冠状病毒(CCoV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、牛冠状病毒(BoCoV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS
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CoV)和猪血凝性脑脊髓炎冠状病毒(PHE
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CoV)。13.权利要求12的疫苗组合物，其中所述冠状病毒选自猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)、猪急性腹泻冠状病毒(SADS
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CoV)和SARS
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CoV
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2。14.权利要求13的疫苗组合物，其中所述冠状病毒是猪PEDV。15.权利要求14的疫苗组合物，其中Nsp1中的突变是如SEQ ID NO：4中所示的F44A，Nsp15突变是如SEQ ID NO：8中所示的H226A和H241A，且Nsp16突变是如SEQ ID NO：12中所示的D129A。16.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述冠状病毒是活的且减毒的。17.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其中所述免疫应答包括干扰素产生、干扰素诱导的具有三十四肽重复2的蛋白(IFIT2或ISG54)的产生和抗体产生。18.权利要求17的疫苗组合物，其中所述干扰素产生包括I型IFN
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β和III型IFN
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λ产生。
19.权利要求18的疫苗组合物，其中所述干扰素产生是从野生型冠状病毒感染产生的水平的2倍。20.权利要求17的疫苗组合物，其中所述免疫应答包括中和抗体应答。21.疫苗组合物，其包含活的减毒的猪流行性腹泻病毒(PEDV)，其中所述PEDV包含如SEQ ID NO：4中所示的Nsp1中的F44A取代突变、如SEQ ID NO：8中所示的Nsp15中的H226A和H241A取代突变和如SEQ ID NO：12中所示的Nsp16中的D129A取代突变；其中所述疫苗组合物能够诱导I型IFN
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β和III型IFN
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λ产生和中和抗体应答。22.治疗或预防与冠状病毒相关的疾病的方法，其包括向受试者施用组合物，所述组合物包含冠状病毒，所述冠状病毒在至少两种非结构蛋白各自中具有至少一个突变，其中所述疫苗组合物能够在受试者中诱导免疫应答。23.权利要求22的方法，其中所述冠状病毒在三种非结构蛋白各自中包含至少一个突变。24.权利要求22的方法，其中所述冠状病毒包含第一非结构蛋白中的至少一个突变、第二非结构蛋白中的至少一个突变和第三非结构蛋白中的至少两个突变。25.权利要求22
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24中任一项的方法，其中所述非结构蛋白中的至少两种是干扰素拮抗剂。26.权利要求25的方法，其中所述冠状病毒包含第一非结构蛋白中的至少一个突变、第二非结构蛋白中的至少一个突变和第三非结构蛋白中的至少两个突变，其中每种非结构蛋白是干扰素拮抗剂。27.权利要求25或权利要求26的方法，其中至少两个突变位于所述至少两种非结构蛋白各自的催化位点中。28.权利要求22
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26中任一项的方法，其中所述非结构蛋白选自Nsp1、Nsp15和Nsp16。29.权利要求28的方法，其中所述冠状病毒包含Nsp1中的一个突变、Nsp15中的两个突变和Nsp16中的一个突变。30.权利要求29的方法，其中Nsp15中的所述两个突变和Nsp16中的所述一个突变位于Nsp15和Nsp16的催化位点中。31.权利要求29的方法，其中突变Nsp1是苯丙氨酸至丙氨酸取代，Nsp15突变都是组氨酸至丙氨酸取代，且Nsp16突变是天冬氨酸至丙氨酸取代。32.权利要求22
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31中任一项的方法，其中所述冠状病毒选自严重急性呼吸综合征冠状病毒
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2(SARS
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CoV
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2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS
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CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS
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CoV)、人冠状病毒229E(HCoV
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229E)、人冠状病毒0C43(HCoV
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0C43)、人冠状病毒HKU1(HCoV
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HKU1)、人冠状病毒NL63(HCoV
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NL63)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、犬冠状病毒(CCoV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、牛冠状病毒(BoCoV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS
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CoV)和猪血凝性脑脊髓炎冠状病毒(PHE
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CoV)。33.权利要求32的方法，其中所述冠状病毒选自猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和SARS
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CoV
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2。34.权利要求33的方法，其中所述冠状病毒是猪流行性腹泻病毒(PEDV)。35.权利要求34的方法，其中Nsp1中的突变是如SEQ ID NO：4中所示的F44A，Nsp15突变
是如SEQ ID NO：8中所示的H226A和H241A，且Nsp16突变是如SEQ ID NO：12中所示的D129A。36.权利要求22
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35中任一项的方法，其中所述冠状病毒是活的且减毒的。37.权利要求22
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36中任一项的方法，其中所述免疫应答包括干扰素产生、干扰素诱导的具有三十四肽重复2的蛋白(IFIT2或ISG54)的产生和抗体产生。38.权利要求37的方法，其中所述干扰素产生包括I型IFN
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β和III型IFN
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λ产生。39.权利要求38的方法，其中所述干扰素产生是从野生型冠状病毒感染产生的水平的2倍。40.权利要求37的方法，其中所述免疫应答包括中和抗体应答。41.权利要求22
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40中任一项的方法，其中所述疾病选自呼吸道疾病、胃肠道疾病和神经系统疾病。42.权利要求41的方法，其中所述呼吸道疾病选自严重急性呼吸综合征、急性呼吸窘迫综合征或肺炎。43.权利要求41的方法，其中所述胃肠道疾病包括选自以下的一种或多种症状：腹泻、脱水和胃肠道不适。44.权利要求41的方法，其中所述神经系统疾病是脑炎。45.权利要求22
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44中任一项的方法，其中所述受试者是哺乳动物。46.权利要求45的方法，其中所述哺乳动物是猪或人。47.治疗或预防与冠状病毒相关的疾病的方法，其包括向受试者施用组合物，所述组合物包含活的减毒的猪流行性腹泻病毒(PEDV)，其中所述PEDV包含如SEQ ID NO：4中所示的Nsp1中的F44A取代突变、如SEQ ID NO：8中所示的Nsp15中的H226A和H241A取代突变和如SEQ ID NO：12中所示的Nsp16中的D129A取代突变；其中所述疫苗组合物能够诱导I型IFN
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β和III型IFN
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λ产生和中和抗体应答。48.制备突变的冠状病毒或冠状病毒疫苗组合物的方法，其包括以下步骤：(a)鉴定冠状病毒基因组中至少两种非结构蛋白中的至少一个催化残基；和(b)突变所述至少一个催化残基；...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：美国政府农业部，
类型：发明
国别省市：