一种水稻粳-籼亚种的检测引物组、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种水稻粳

【技术实现步骤摘要】
一种水稻粳
‑
籼亚种的检测引物组、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及水稻粳
‑
籼亚种的检测方法，具体来说是一种水稻粳
‑
籼亚种的检测引物组、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]亚洲水稻可分为籼稻、粳稻这两个亚种，在国际上也称为Oryza sativa L.subs.indica亚种与Oryza sativa L.subs.japonica亚种。
[0003]目前对籼稻、粳稻进行鉴别的主要方法是通过形态学鉴别，这种鉴别方法存在中间过渡类型而不能清晰进行鉴别的缺点，并且由于长期的自然或人为杂交，水稻的遗传信息交流频繁，细胞核的DNA成分复杂，因此，基于核DNA的差异标记进行籼
‑
粳亚种的鉴别难度较大。
[0004]有研究人员发现在籼稻叶绿体DNA的Pst I
‑
12片段ORF100区域有69bp碱基缺失，与粳稻存在较大的差异。目前已有基于此缺失片段建立的普通PCR技术及荧光PCR技术，但是普通PCR技术还需结合琼脂糖凝胶电泳才能辨别结果，荧光PCR所需试剂及设备成本较高，不适合大规模推广，相较于前两种方法，环介导等温扩增技术(LAMP)显示出了其独特的优越性。
[0005]环介导等温扩增技术(LAMP)是一种快速的DNA检测技术，不需要PCR仪，而是在等温条件下(通常为60
‑
65℃)使用一组识别目标核苷酸序列中六个不同区域的四种引物扩增特定DNA。因此，LAMP产生了特异性的长扩增产物，可以被观察到。由于扩增产物由多重复靶序列的茎环状和花椰菜状组成，通过琼脂糖凝胶电泳检测会呈现特有的梯形条带。但这种方法耗时较长，且需要打开反应管进行电泳操作，很容易造成假阳性污染。在扩增反应过程中形成大量核酸扩增产物时，产生肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀，直接通过浊度仪来判断扩增结果，但反应难以通过肉眼观察。
[0006]因此有必要研究一种简单、且可以通过肉眼直接观察的检测方法，从而快速鉴别水稻属于籼稻还是粳稻。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种水稻粳
‑
籼亚种的检测引物组，所述引物组包括一对外引物、一对内引物；
[0008]上游外引物F3：5
’
CTATTTTTGTTCTTATACCCATGC3
’
(SEQ ID NO:1)；
[0009]下游外引物B3：5
’
ATCTATGGGGTCACAGCC3
’
(SEQ ID NO:2)；
[0010]上游内引物FIP：5
’
CCAAGAAAGGCTATTTTTTAAGGGAAATAGAGAGCGA GTGGGAA3
’
(SEQ ID NO:3)；
[0011]下游内引物BIP：5
’
ATGGAATAATCCTGAATTCCAATGTGGTCGTGGTAAATC CATGAA3
’
(SEQ ID NO:4)。
[0012]其中，所述上游内引物FIP包含F1c和F2：
[0013]F1c：5
’
CCAAGAAAGGCTATTTTTTAAGGGA3
’
；
[0014]F2：5
’
AATAGAGAGCGAGTGGGAA3
’
。
[0015]其中所述下游内引物BIP包含B1c和B2：
[0016]B1c：5
’
ATGGAATAATCCTGAATTCCAATG3
’
；
[0017]B2：5
’
TGGTCGTGGTAAATCCATGAA3
’
。
[0018]本专利技术还提供了一种水稻粳
‑
籼亚种的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括前述的检测引物组。
[0019]优选地，所述检测试剂盒还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、阴性对照。
[0020]进一步优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
[0021]进一步优选地，所述LAMP反应液含有MgSO4、dNTPs、甜菜碱、10
×
ThermoPol Buffer缓冲液。
[0022]更进一步优选地，所述LAMP反应液中还包括显色体系，所述显色体系为羟基萘酚蓝。
[0023]进一步优选地，所述阴性对照为ddH2O。
[0024]优选地，所述上游外引物F3的终浓度范围为0.175μM至0.225μM；所述下游外引物B3的终浓度范围为0.175μM至0.225μM；所述上游内引物FIP的终浓度范围为1.4μM至1.8μM；所述下游内引物BIP的终浓度范围为1.4μM至1.8μM。
[0025]本专利技术还提供了一种水稻粳
‑
籼亚种的检测方法，采用前述的检测引物组进行检测，所述方法包括如下步骤：
[0026]步骤S1：提取水稻基因组DNA；
[0027]步骤S2：配制25μL反应体系，含有终浓度范围为0.175μM至0.225μM的上游外引物F3，终浓度范围为0.175μM至0.225μM的下游外引物B3，终浓度范围为1.4μM至1.8μM的上游内引物FIP，终浓度范围为1.4μM至1.8μM的下游内引物BIP，8mM的MgSO4，3mM的HNB，1.4mM的dNTPs，0.8M的甜菜碱，10
×
ThermoPol Buffer缓冲液，320U/mL的Bst聚合酶，模板DNA 2μL，用ddH2O补齐到25μL；
[0028]步骤S3：环介导等温扩增反应：在63℃至65℃扩增反应45min至60min；
[0029]步骤S4：步骤S3扩增反应完成后，根据颜色反应读取结果，阴性为紫色，说明水稻品种为籼稻；阳性为蓝色，说明水稻品种为粳稻。
[0030]本专利技术提供的一种水稻粳
‑
籼亚种的检测引物组、试剂盒和检测方法，具有以下优点：
[0031]1、经过实际实验验证，引物达到扩增效率及结果最佳。
[0032]2、反应不需要PCR仪，仅需一台金属浴或者水浴锅保持63℃至65℃恒温，极大节省了检测成本。
[0033]3、检测结果可通过肉眼观察显色变化来判断，适合于现场检测。
[0034]4、整个扩增反应过程在1小时内完成，与其他方法相比方便快捷。
[0035]5、检测灵敏。通过与传统PCR检测相比，检测灵敏度提高了100倍。
附图说明
[0036]图1：本专利技术水稻基因组DNA扩增结果。
[0037]其中：1号管为加水阴性对照，结果呈紫色；2号管为玉针香基因组DNA模板，结果2号管呈紫色，说明2号管水稻为籼型水稻；3号管为南粳46基因组DNA模板，结果呈蓝色，说明3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻粳
‑
籼亚种的检测引物组，其特征在于：所述引物组包括一对外引物、一对内引物；上游外引物F3：5
’
CTATTTTTGTTCTTATACCCATGC3
’
；下游外引物B3：5
’
ATCTATGGGGTCACAGCC3
’
；上游内引物FIP：5
’
CCAAGAAAGGCTATTTTTTAAGGGAAATAGAGAGCGA GTGGGAA3
’
；下游内引物BIP：5
’
ATGGAATAATCCTGAATTCCAATGTGGTCGTGGTAAAT CCATGAA3
’
。2.一种水稻粳
‑
籼亚种的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组。3.根据权利要求2所述的水稻粳
‑
籼亚种的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、阴性对照。4.根据权利要求3所述的水稻粳
‑
籼亚种的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。5.根据权利要求3所述的水稻粳
‑
籼亚种的检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液包括MgSO4、dNTPs、甜菜碱、10
×
ThermoPol Buffer缓冲液。6.根据权利要求5所述的水稻粳
‑
籼亚种的检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：方勇，李心月，李彭，裴斐，沈飞，邢常瑞，
申请(专利权)人：南京财经大学，
类型：发明
国别省市：