生物膜保存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种生物膜保存液及其制备方法和应用，所述生物膜保存液包括硫酸软骨素、稳定剂、透明质酸钠、甘油、冷冻保护剂、含硫化合物和HC

【技术实现步骤摘要】
生物膜保存液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医用材料
，更具体地，本专利技术涉及一种生物膜保存液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]在胎盘哺乳动物中，羊膜(厚约0.02～0.05mm)来源于胚胎，是一种透明、无神经、血管和淋巴管、低抗原性且具有韧性的组织，由上皮细胞层、基底膜、基质层、纤维母细胞层、海绵层组成。脐带将发育中的胎儿连接到胎盘，脐带由羊膜(UCAM)和沃顿氏胶制成。
[0003]新鲜羊膜(包括来源于脐带的羊膜)中包含多种胶原蛋白以及层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖、透明质酸等，这些活性物质可以促进上皮细胞的黏附移行，诱导上皮分化，防止上皮凋亡；羊膜细胞及基质中还包含多种生长因子，如神经生长因子(NGF)，肝细胞生长因子(HGF)，角质细胞生长因子(KGF)，转化生长因子
‑
α(TGF
‑
α)，转化生长因子
‑
β1(TGF
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β1)，表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；此外，羊膜细胞及基质中还包含抑制血管生成、抗炎的蛋白以及一些天然蛋白酶抑制因子，这些因子成分能够促进上皮生长、抑制炎性反应、抑制纤维组织过度增生和新生血管形成。羊膜在促进上皮修复、愈合及分化，抑制炎症，抗新血管生成，抑制纤维化及瘢痕化，防止睑球粘连等眼科多个领域发挥着重要的作用。
[0004]包括羊膜在内的生物膜，需要采用不同的保存液进行保存。而不同的保存方法对生物膜的结构和生物学活性有不同的影响。现在使用较为普遍的生物膜保存液为DMEM和甘油混合液(体积比DMEM：甘油＝1：1)，将生物膜片放入装有DMEM和甘油混合液的容器中，密封置于
‑
70℃冰箱保存备用，该保存液会使生物膜上皮细胞形态改变，代谢酶活性和生长因子的表达降低，且过快的降温会造成细胞水肿，发生老化及功能减退，从而影响生物膜的品质。
[0005]申请号为200710150436.9的中国专利公开了“一种新鲜羊膜保存液及新鲜羊膜保存方法与应用”，该新鲜羊膜保存液的组成及含量为：DMEM培养基9.0～12.0克，硫酸软骨素10.0～25.0克，透明质酸钠0.5～1.0克，HEPES 4.0～5.0克，右旋糖苷10.0～15.0克，庆大霉素1.0～3.0毫升，地塞米松24.0～30.0毫克，非必需氨基酸10.0～15.0毫升，还原型谷胱甘肽0.50～0.95克，胎牛血清20.00～50.0毫升，注射用水加至1000毫升。该新鲜羊膜保存液具有在4℃冰箱中保存，将新鲜羊膜保存期延长20～30天的优点。但该保存液中由于加入了血清成分，增加了跨种病毒在羊膜与保存液之间传播的机会。
[0006]有研究比较了Hank
’
s平衡盐/甘油溶液深低温(
‑
80℃)保存、纯甘油4℃保存、冷冻干燥常温保存法对羊膜生物学性能的影响，结果显示：1、与新鲜羊膜相比，保存的羊膜在胶原酶Ⅳ溶液中降解速度均有所加快，其中纯甘油4℃保存的羊膜的降解速度最快，冷冻干燥保存的羊膜的降解速度最慢；2、冷冻干燥保存的羊膜中被检测的8种细胞因子残存量在40％左右；Hank
’
s平衡盐/甘油溶液深低温保存和纯甘油4℃保存的羊膜中的8种细胞因子残存量均低于20％。因此，3种方法中以冷冻干燥常温法保存羊膜的效果最好，但活性因子
的丢失率还是很高。
[0007]为避免生物膜材料在使用过程中的感染风险，生物膜在临床使用之前，应进行灭活病毒或者灭菌处理。然而生物膜在经辐照灭活病毒或者灭菌处理时，通常会对生物膜材料的胶原结构造成一定的破坏，从而降低生物膜材料的物理性能以及生物性能。以往报道的生物膜保存液主要的关注点在于保护生物膜的细胞活性以及各项活性因子，较少关注到生物膜经保存液保存后，是否可以保护其不受辐照损伤。
[0008]因此，提供一种活性因子丢失率低，可避免生物膜材料在经辐照灭活病毒或者灭菌过程中损坏变性，生物膜临床使用疗效高的保存液，具有重大的临床意义。

技术实现思路

[0009]基于此，本专利技术的目的在于提供一种生物膜保存液及其制备方法和应用，所述生物膜保存液可以使保存的生物膜含有的活性因子丢失率低，且在经辐照灭活病毒或灭菌过程中不易损坏变性。
[0010]实现上述专利技术目的的技术方案包括如下。
[0011]本专利技术的第一个方面，是提供了一种生物膜保存液，所述生物膜保存液包括以下组分：10～25g/L硫酸软骨素、100～200mg/L稳定剂、5～50g/L透明质酸钠、200～500g/L甘油、0.1％～5％v/v冷冻保护剂、5000～20000ng/L含硫化合物、0.01～7g/L HC
‑
HA/PTX3复合物。
[0012]本专利技术的第二个方面，是提供了所述生物膜保存液的制备方法。
[0013]所述生物膜保存液的制备方法，其步骤包括，将所有组分加入到注射用水中混合均匀后，调节pH为7.2～7.4，渗透压为350～380mOsm/L，即得。
[0014]本专利技术的第三个方面，是提供了上述生物膜保存液在生物膜保存中的应用。
[0015]本专利技术的生物膜保存液，通过添加HC
‑
HA/PTX3复合物和含硫化合物，并配合其他组分共同作用，使其在10℃～
‑
20℃的条件下均实现良好的保存效果，保存后的生物膜的形态未改变，含有的活性因子丢失率低(10℃保存2周，活性因子保存率50％以上，
‑
20℃下保存半年，活性因子保存率可达60％以上，
‑
20℃下保存1年，活性因子保存率可达50％以上)，同时可避免生物膜材料在经辐照灭活病毒或者灭菌过程中损坏变性，经保存后的生物膜临床使用疗效比新鲜羊膜使用疗效更高，可以广泛应用于生物制药、医疗领域中。
附图说明
[0016]图1为本专利技术试验例1中不同样品中生长因子的含量对比结果；其中，实验组与对照组(新鲜羊膜)相比，**P＜0.01，*P＜0.05；实验组与对比例组相比，
※※
P＜0.01，
※
P＜0.05。
[0017]图2为本专利技术试验例3中实验组样品和对照组样品的颜色变化对比。
[0018]图3为本专利技术试验例3中实验组样品的柔韧性结果。
[0019]图4为本专利技术试验例4中新鲜羊膜、本专利技术实施例2的保存液保存的生物羊膜以及对比例2的保存液保存的生物羊膜的临床使用效果对比结果。
具体实施方式
[0020]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0021]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物膜保存液，其特征在于，包括以下组分：10～25g/L硫酸软骨素、100～200mg/L稳定剂、5～50g/L透明质酸钠、200～500g/L甘油、0.1％～5％v/v冷冻保护剂、5000～20000ng/L含硫化合物、0.01～7g/L HC
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HA/PTX3复合物。2.根据权利要求1所述的生物膜保存液，其特征在于，包括以下组分：14～16g/L硫酸软骨素、100～120mg/L稳定剂、15～25g/L透明质酸钠、250～350g/L甘油、1.5％～2.5％v/v冷冻保护剂、8000～12000ng/L含硫化合物、0.8～1.2g/LHC
‑
HA/PTX3复合物。3.根据权利要求1或2所述的生物膜保存液，其特征在于，所述含硫化合物为半胱氨酸、半胱胺、2
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氨乙基硫代硫酸、硫脲中的至少一种。4.根据权利要求1或2所述的生物膜保存液，其特征在于，所述稳定剂为抗坏血酸、维生素E、维生素C、胡萝卜素、SOD中的至少一种；和/或所述冷冻保护剂为右旋糖酐或二甲基亚砜。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：林永亮，何海娜，吴有陵，刘艳丽，罗锦荣，胡楚龙，范文婷，
申请(专利权)人：广州瑞泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：