一种针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别方法及其特异性引物技术

本发明专利技术涉及一种针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别方法及其特异性引物。该鉴别方法采用由正向引物SEQ ID NO.1和反向引物SEQ ID NO.2构成的特异性引物，针对目标鱼的基因组DNA进行PCR扩增，并以琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增反应产物进行检测，最后根据电泳图结果直接得出鉴别结果。本发明专利技术鉴别方法只需针对鱼种基因组DNA进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，即可根据电泳结果中清晰且差异明显的扩增条带直接得出针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别结果，快速准确，成本低，操作简单，实用性强。实用性强。

【技术实现步骤摘要】
一种针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别方法及其特异性引物


[0001]本专利技术涉及一种针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别方法及其特异性引物，属于水产养殖


技术介绍

[0002]黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)和长吻鮠(Leiocassis longirostris)分别隶属于鲇形目鲿科黄颡鱼属和鮠属，是鲿科鱼类中两个具有经济价值的养殖品种，肉嫩刺少且味道鲜美，深受消费者喜欢。虽然当前鲿科鱼类繁养规模迅速扩大，但是相关的种质改良研究却明显滞后。目前已有许多针对鲿科鱼类远缘杂交的研究，但未见有关黄颡鱼和长吻鮠育种方面的报道。黄颡鱼因饲养成活率高、适应性强等特点，已成为重要的淡水鱼类养殖对象。长吻鮠相比于黄颡鱼有着生长速度快和营养价值高等特点。为整合两种鱼的优势，通过黄颡鱼(
♀
)和长吻鮠(
♂
)所获得的杂交F1代具有生长快速、抗逆性强等优点，有望开发成黄颡鱼新品系。但由于该杂交F1代通常具有两种亲本的形态特征，容易造成混淆，不易直接分辨，亟待研发出能够对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代进行区分的鉴定技术手段。
[0003]微卫星是由2至6个核苷酸组成的具有高度变异性的简单重复DNA序列，具有多态性、杂合率高、共显性遗传等特点。微卫星标记现已在水产动物的群体遗传结构的分析、物种遗传多样性的鉴定以及遗传基因连锁图谱的构建等方面得到应用。但目前为止，关于黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴定研究尚未有报道。
[0004]经检索发现，申请号CN201610159878.9、申请公布号CN105695590A的专利技术专利申请公开了一种用于鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的引物组、试剂盒和方法，可鉴定黄颡鱼和长吻鮠杂交种的父本和母本。然而，该技术方案是用来鉴定黄颡鱼、长吻鮠谁为父本谁为母本，并不能用来鉴别区分黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代；其引物是基于COI基因和ITS序列设计的引物，并非针对微卫星设计；在基于COI基因进行PCR扩增反应后需测序并构建进化树聚类图，方可鉴定出杂交种的父母本，过程稍显繁琐。
[0005]专利号CN201910755624.7、授权公告号CN110331217B的专利技术专利公开了一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物、方法及应用，然而其技术方案是用来指导这三种罗非鱼在育种过程中的种群遗传和家系系谱管理，并非用来直接鉴别区分这三种罗非鱼，而且这三种罗非鱼与黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代差异巨大，无法直接套用；此外，其技术手段需要用到荧光标记微卫星引物PCR扩增和多重毛细管电泳分型，以及需要利用软件进行亲权鉴定，稍显繁琐。因此，该技术方案对于鉴别区分黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代并无教导或启示。
[0006]专利号CN202010344849.6、授权公告号CN111394478B的专利技术专利公开了一种PCR微卫星引物及其用于大黄鱼亲子鉴定的方法，然而其技术方案是用来解决现有的大黄鱼近亲交配、种群遗传多样性下降的问题，能够根据基因型进行大黄鱼待测样品之间的亲子鉴定，但并非用来直接鉴别区分各鱼种，而且大黄鱼与黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代差异巨
大，无法直接套用；此外，其技术手段需要利用软件进行亲子鉴定，稍显繁琐。因此，该技术方案对于鉴别区分黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代并无教导或启示。
[0007]本专利技术的专利技术人课题组曾申请专利技术专利《一种用于鉴别暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及杂交东方鲀的特异性引物及其方法》(专利号CN 202010781478.8、授权公告号CN111979336B)，利用微卫星标记技术，通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果即可直接区分暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交东方鲀[暗纹东方鲀(
♀
)
×
红鳍东方鲀(
♂
)]。然而，该鉴定方法仅适用于暗纹东方鲀、红鳍东方鲀及其杂交东方鲀，这些鱼种与黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代差异巨大，研究者无法从现有技术中找到依据以直接断定能够成功建立针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的利用微卫星标记技术的鉴定方法，只能通过实践研究进行不断尝试与改进才能最终确认其可行性。专利技术人课题组通过实践研究获得了最新的研究成果，并以此来申报本专利技术专利。

技术实现思路

[0008]本专利技术的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别方法，操作简便，能快速、准确地鉴别这三者；同时还提供该鉴别方法中采用的特异性引物、以及试剂盒。
[0009]本专利技术解决其技术问题的技术方案如下：
[0010]一种针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别方法，其特征是，包括以下步骤：
[0011]第一步、从鱼群中取一条鱼作为目标鱼，所述鱼群含有黄颡鱼、长吻鮠、以黄颡鱼为母本且以长吻鮠为父本的杂交F1代之一、之二或三者；提取目标鱼的基因组DNA；
[0012]第二步、采用特异性引物针对目标鱼的基因组DNA进行PCR扩增；所述特异性引物由正向引物和反向引物构成，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；所述特异性引物针对的微卫星标记的序列为5
′‑
aaataaataaataaat
‑3′
；
[0013]第三步、采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增反应产物进行检测；根据琼脂糖凝胶电泳检测结果鉴别目标鱼：当检测结果有一个条带且位于150
±
10bp时，该目标鱼为黄颡鱼；当检测结果有一个条带且位于230
±
10bp时，该目标鱼为长吻鮠；当检测结果有两个条带，一个条带位于150
±
10bp且另一个条带位于230
±
10bp时，该目标鱼为以黄颡鱼为母本且以长吻鮠为父本的杂交F1代。
[0014]专利技术人课题组在前期调研中得知，传统微卫星序列的筛选方法主要是利用重复探针筛选基因组文库和阳性克隆测序来开发对应的序列和引物，其操作困难且耗时、低效。专利技术人课题组在实践研究中，采用对黄颡鱼全基因组中所有的微卫星进行全覆盖搜索的方法进行研究，更简单快捷地获得了目标微卫星及其特异性引物，并获得以此为基础的利用微卫星标记技术的上述鉴别方法，能够快速、准确地鉴别黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代。
[0015]优选地，第一步中，所述鱼群由黄颡鱼、长吻鮠、以黄颡鱼为母本且以长吻鮠为父本的杂交F1代之一、之二或三者构成；从目标鱼身上剪下适量组织，然后从该组织中提取目标鱼的基因组DNA；所述组织为尾鳍。
[0016]采用该优选方案，可进一步优化第一步的具体细节特征；其中，采用少量尾鳍即可进行鉴别，不需要处死目标鱼，可进一步降低鉴别成本。
[0017]优选地，第二步中，所述特异性引物针对的微卫星标记及其上下游的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0018]更优选地，所述PCR扩增反应体系为20μL体系，含有：灭菌水7.4μL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别方法，其特征是，包括以下步骤：第一步、从鱼群中取一条鱼作为目标鱼，所述鱼群含有黄颡鱼、长吻鮠、以黄颡鱼为母本且以长吻鮠为父本的杂交F1代之一、之二或三者；提取目标鱼的基因组DNA；第二步、采用特异性引物针对目标鱼的基因组DNA进行PCR扩增；所述特异性引物由正向引物和反向引物构成，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；所述特异性引物针对的微卫星标记的序列为5
′‑
aaataaataaataaat
‑3′
；第三步、采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增反应产物进行检测；根据琼脂糖凝胶电泳检测结果鉴别目标鱼：当检测结果有一个条带且位于150
±
10bp时，该目标鱼为黄颡鱼；当检测结果有一个条带且位于230
±
10bp时，该目标鱼为长吻鮠；当检测结果有两个条带，一个条带位于150
±
10bp且另一个条带位于230
±
10bp时，该目标鱼为以黄颡鱼为母本且以长吻鮠为父本的杂交F1代。2.根据权利要求1所述的一种针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别方法，其特征是，第一步中，所述鱼群由黄颡鱼、长吻鮠、以黄颡鱼为母本且以长吻鮠为父本的杂交F1代之一、之二或三者构成；从目标鱼身上剪下适量组织，然后从该组织中提取目标鱼的基因组DNA；所述组织为尾鳍。3.根据权利要求1所述的一种针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别方法，其特征是，第二步中，所述特异性引物针对的微卫星标记及其上下游的序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求3所述的一种针对黄颡鱼、长吻鮠及其杂交F1代的鉴别方法，其特征是，所述PCR扩增反应体系为20μL体系，含有：灭菌水7.4μL，2
×
Taq Plus Mix 10μL，10μM正反特异性引物各0.8μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，王玲玲，彭冶，张艺然，尹绍武，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：