稳定、可视化的白蛋白检测剂的制备及应用制造技术

本发明专利技术提出了稳定、可视化的白蛋白检测剂的制备及应用，该白蛋白检测剂由上转换纳米粒子、猝灭剂和抗体组成。所述上转换纳米粒子包括核层和壳层。其中，核层包括NaYF4:Yb

【技术实现步骤摘要】
稳定、可视化的白蛋白检测剂的制备及应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及稳定、可视化的白蛋白检测剂的制备方法，更具体地，本专利技术涉及一种上转换纳米粒子、复合纳米粒子、制备上转换纳米粒子的方法、制备复合纳米粒子的方法、检测白蛋白含量的方法及判断细胞分化状态的方法。

技术介绍

[0002]小鼠白蛋白(MSA)由小鼠肝细胞分泌后进入血液，是血浆中的主要蛋白质，维持机体营养和渗透压。在细胞分化过程中，白蛋白的浓度可以间接地反映干细胞向肝细胞分化的程度。目前生物学关于白蛋白的检测主要采用酶联免疫检测(ELISA)法，但是，ELISA方法存在以下问题：(1)ELISA法往往采用单一荧光检测，容易受背景荧光、液体环境等影响，造成测量误差，且检测灵敏度较低；(2)大多数ELISA检测剂属于有机物，检测剂的物理化学性质不稳定，斯托克斯位移小，造成测量误差；(3)某些生物标记物的检测只能在体外进行，无法实现体内实时、动态监测。因此迫切需要一种受周围环境影响小、稳定性高、可以实时并用于细胞内白蛋白浓度的高效检测。
[0003]近年来，上转换纳米粒子(UCNPs)在生物传感领域展现出广阔的前景，UCNPs具有粒径小、形状可调、稳定性高、发射带宽窄、荧光寿命长、发射范围广、生物相容性好、表面易修饰等优点。小粒径、强荧光发射的UCNPs经过表面修饰后，可以在其表面加载抗原、抗体、有机小分子等；这些材料的加载赋予了UCNPs众多的功能，使其作为一类多功能的复合纳米粒子，在生物医学等领域发挥着重要作用，但目前并未出现将上转换纳米粒子用于活细胞或类器官等样本进行白蛋白的高效、实时动态检测。

技术实现思路

[0004]本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
[0005]专利技术人经过大量的实验研究，惊喜地发现一种稳定、可视化、可活体内实时检测的白蛋白检测剂，所述检测剂受环境影响小、稳定性好，在不同液体中均可以实现白蛋白浓度的准确检测；并且可以实现细胞内部白蛋白实时、动态、可视化的检测，可以实现小鼠肝脏类器官的荧光成像；此外，该检测剂无需标记，操作简单，使用方便，生物相容性好，检测灵敏度高。
[0006]为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种上转换纳米粒子。根据本专利技术的实施例，包括：核层，所述核层包括NaYF4:Yb
3+
/Er
3+
；以及壳层，所述壳层设置在所述核层的外表面，所述壳层包括NaYF4。根据本专利技术实施例的上转换纳米粒子，在可见光照射下可发出绿色和红色荧光，当所述可见光波长为535nm～550nm时出现绿色荧光发射峰；当所述可见光波长为645nm～665nm出时现红色荧光发射峰，其中荧光强度灵敏度较高，减少周围环境的影响后，可显著提高检测白蛋白的灵敏度，稳定、有效的利用荧光强度和荧光强度比技术获得白蛋白浓度。
[0007]根据本专利技术的实施例，上述上转换纳米粒子还可以进一步包括如下附加技术特征
至少之一：
[0008]根据本专利技术的实施例，所述核层的粒径为25nm。
[0009]根据本专利技术的实施例，所述壳层的粒径为35nm。
[0010]根据本专利技术的实施例，所述Y
3+
是以YCl3·
6H2O的形式提供的，所述Yb
3+
是以YbCl3·
6H2O的形式提供的，所述Er
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是以ErCl3·
6H2O的形式提供的。根据本专利技术实施例的形式提供Y
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、Yb
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和Er
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制备得到的上转换纳米粒子具有更好的发光效果。
[0011]根据本专利技术的实施例，所述核中Y
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、Yb
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、Er
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的摩尔比为78～82：16～20：1～2。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述核中Y
3+
、Yb
3+
、Er
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的摩尔比为40：9：1。
[0013]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种复合纳米粒子。根据本专利技术的实施例，包括：第一方面所述的上转换纳米粒子、白蛋白抗体(antibody，Ab)以及孟加拉红溴己酸之间。根据本专利技术实施例的复合纳米粒子可以对不同液体环境中存在的白蛋白进行有效检测，且在双光子显微镜的激光照射下，可以实现类器官明亮的荧光成像，对类器官细胞内的白蛋白进行动态的可视化检测；采用溶剂热制备核壳结构纳米粒子，再通过配体交换加载表面修饰剂，利用胺基羧基脱水缩合加载抗体Ab和猝灭剂孟加拉红溴己酸(RBHA)，在合适的距离内，孟加拉红溴己酸可有效猝灭上转换纳米粒子的荧光。
[0014]根据本专利技术的实施例，上述复合纳米粒子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0015]根据本专利技术的实施例，所述白蛋白抗体包括人源白蛋白抗体或鼠源白蛋白抗体。所述白蛋白存在于含有PBS的溶液、含有DMEM和FBS溶液(DFS)或含有ADGS培养基的溶液、细胞或类器官中的至少之一。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述ADGS培养基包括：Advanced DMEM/F12，B27，N2，青链霉素混合液，N
‑
乙酰半胱氨酸，GlutaMax，表皮生长因子(EGF)，FGF10，胃泌素(Gastrin)，A83
‑
01，4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，CHIR99021，肝细胞生长因子(HGF)，尼克酰胺，Y
‑
27632，R
‑
spondin1，TNF
‑
α。
[0017]根据本专利技术的实施例，进一步包括牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯亚胺(PEI)。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述白蛋白抗体通过共价键与加载有聚乙烯亚胺的上转化纳米颗粒进行连接。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述白蛋白抗体与加载有聚乙烯亚胺的上转化纳米颗粒的质量比为7：500。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述孟加拉红溴己酸是通过共价键与所述白蛋白抗体进行连接。
[0021]根据本专利技术的实施例，所述孟加拉红溴己酸与所述白蛋白抗体的质量比为25：2。
[0022]根据本专利技术的实施例，所述孟加拉红溴己酸由孟加拉红与溴己酸反应获得的。
[0023]在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种制备第一方面所述的上转换纳米粒子的方法。根据本专利技术的实施例，包括：1)将Y
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盐、Yb
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盐、Er
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盐与油酸、十八烯在氮气存在下进行第一加热处理，任选地，所述加热处理是在温度为120～170℃进行的；2)将步骤1)所得产物冷却至室温后，与氢氧化钠、氟化铵、甲醇进行混合；3)将步骤2)所得产物分别于50～90℃加热25～35min，280～320℃加热50～70min；4)将步骤3)所得产物进行冷却本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种上转换纳米粒子，其特征在于，包括：核层，所述核层包括NaYF4:Yb
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/Er
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；以及壳层，所述壳层设置在所述核层的外表面，所述壳层包括NaYF4:Yb
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/Er
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@NaYF4；任选地，所述核层的粒径为25nm；任选地，所述壳层的粒径为35nm；任选地，所述Y
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是以YCl3·
6H2O的形式提供的，所述Yb
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是以YbCl3·
6H2O的形式提供的，所述Er
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是以ErCl3·
6H2O的形式提供的；任选地，所述核层中Y
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、Yb
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、Er
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的摩尔比为78～82：16～20：1～2；优选地，所述核层中Y
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、Yb
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、Er
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的摩尔比为40：9：1。2.一种复合纳米粒子，其特征在于，包括：权利要求1所述的上转换纳米粒子、白蛋白抗体以及孟加拉红溴己酸，所述白蛋白抗体搭载于所述上转换纳米粒子的外表面，并且所述白蛋白抗体加载于所述上转换纳米粒子与所述孟加拉红溴己酸之间。3.根据权利要求2所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述白蛋白抗体可以识别人源白蛋白或鼠源白蛋白。4.根据权利要求3所述的复合纳米粒子，其特征在于，进一步包括牛血清白蛋白和聚乙烯亚胺。5.根据权利要求4所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述白蛋白抗体通过共价键与加载有聚乙烯亚胺的上转化纳米颗粒进行连接；任选地，所述白蛋白抗体与加载有聚乙烯亚胺的上转换纳米颗粒的质量比为7：500。6.根据权利要求5所述的复合纳米粒子，其特征在于，所述孟加拉红溴己酸是通过共价键与所述白蛋白抗体进行连接；任选地，所述孟加拉红溴己酸与所述白蛋白抗体的质量比为25：2；任选地，所述孟加拉红溴己酸由孟加拉红与溴己酸反应获得的。7.一种制备权利要求1所述的上转换纳米粒子的方法，其特征在于，包括：1)将Y
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盐、Yb
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盐、Er
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盐与油酸、十八烯在氮气存在下进行第一加热处理，任选地，所述加热处理是在温度为120～170℃进行的；2)将步骤1)所得产物冷却至室温后，与氢氧化钠、氟化铵、甲醇进行混合；3)将步骤2)所得产物分别于50～90℃加热25～35min，280～320℃加热50～70min；4)将步骤3)所得产物进行冷却、洗涤、离心处理，以获得所述核层；5)将Y
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盐、油酸、十八烯在氮气存在下进行第二加热处理，任选地，所述第二加热处理是在温度为120～170℃进行的；6)将步骤5)所得产物冷却至室温后，与步骤4)所得核层进行混合，并于70℃加热30min；7)将步骤6)所得产物进行冷却、洗涤、离心处理，以获得所述上转换纳米粒子；任选地，Y
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是以YCl3·
6H2O的形式提供的，所述Yb
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是以YbCl3·
6H2O的形式提供的，所述Er
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是以ErCl3·
6H2O的形式提供的；任选地，所述核层中Y
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、Yb
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、Er
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的摩尔比为78～82：16～20：1～2；优选地，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国锋，王吉华，魏劲松，
申请(专利权)人：德州奥格锐生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：