一种重组卡介苗菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种重组卡介苗菌株rBCG

【技术实现步骤摘要】
一种重组卡介苗菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物制剂
，具体涉及一种重组卡介苗菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]结核病(Tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的一种慢性传染病，被称为细菌性传染病中的“头号杀手”。全球约有四分之一人口感染Mtb。其中10％发展成活动性结核病，造成每年新增结核病患近千万，死亡人数超过百万。卡介苗(Bacille Calmette
‑
Gu
é
rin，BCG)是目前唯一获准的人用结核疫苗，是采用卡介苗菌株制备而成的疫苗。新生儿皮内接种BCG可有效预防儿童粟粒性结核和结核性脑膜炎，降低婴幼儿结核感染的死亡率。但BCG对青少年和成人的保护力较差，导致BCG应用100年来仍不能有效控制结核病的传播。此外，随着耐药结核菌增多，改善BCG疫苗保护能力的需求也日益紧迫。
[0003]肺泡巨噬细胞是抵抗Mtb经呼吸道感染的第一道天然细胞免疫防线。肺泡巨噬细胞在Mtb感染和炎症部位的数量和功能与抗结核感染的免疫力密切相关。其数量的增加和功能的增强有助于Mtb的早期和有效的清除。巨噬细胞也是训练免疫的主要效应细胞。由BCG诱导的训练免疫主要通过单核细胞和巨噬细胞响应细胞因子的水平和活性氧和抗菌肽的释放，控制Mtb等病原微生物感染，并通过表观遗传修饰形成天然免疫记忆，发挥长效的天然免疫保护作用。
[0004]机体抵抗微生物感染依赖趋化因子介导的免疫细胞在微生物入侵部位的聚集和效应功能的活化。CCL2是单核巨噬细胞等免疫效应细胞的高效趋化因子，在生理性免疫防御中协调细胞的迁移。随着对CCL2的深入研究，发现CCL2还可以影响淋巴细胞的粘附、极化、分泌效应分子、自噬、杀伤和存活。CCL2与受体CCR2结合，上调巨噬细胞和骨髓来源单核细胞表达TNF
‑
α、IL
‑
1β、iNOS和IL
‑
6，促进巨噬细胞的M1极化，有利于对入侵微生物的清除和感染的控制。
[0005]CCL2是源自于哺乳动物的蛋白，不存在于原核生物中，由于存在异源表达等障碍，未见在结核分枝杆菌中表达CCL2以提高疫苗保护能力的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术还提供了一种重组质粒，它是包含前述基因的质粒。
[0008]进一步地，所述质粒为大肠杆菌
‑
分枝杆菌穿梭质粒载体pMV261。
[0009]本专利技术还提供了一种重组菌，它是包括前述基因或者前述重组质粒的卡介苗菌株；卡介苗菌株：是指用于制备卡介苗的结核分枝杆菌。
[0010]进一步地，所述卡介苗菌株为牛结核分枝杆菌Mycobacterium bovis BCG str.Pasteur 1173P2。
[0011]更进一步地，所述重组菌表达CCL2蛋白。
[0012]本专利技术还提供了一种前述重组菌的构建方法，它包括以下步骤：
[0013]取前述基因，导入质粒，得到重组质粒，再导入卡介苗菌株，即得；
[0014]进一步地，所述质粒为大肠杆菌
‑
分枝杆菌穿梭质粒载体pMV261。
[0015]本专利技术还提供了一种前述的基因、前述的重组质粒、前述的重组菌在制备预防结核的疫苗中的用途。
[0016]本专利技术最后提供了一种卡介苗，它是包含前述重组菌的疫苗。
[0017]专利技术人在预实验发现，将表达趋化因子CCL2的未经改造的天然基因序列直接经重组质粒导入BCG中，CCL2很难高效表达，也无法从卡介苗菌株中分泌出发挥相应功能，最终无法实现增强BCG疫苗保护能力。
[0018]本专利技术在NCBI数据库中小鼠ccl2基因(GeneBank登录号NM_011333.3)序列的基础上，优化序列构建了能够在牛结核分枝杆菌中有效表达CCL2的重组ccl2基因(rccl2)。用该重组基因导入构建的重组卡介苗菌株rBCG
‑
CCL2不仅具有常规BCG接种激活细胞和体液免疫的作用，还可通过分泌高水平CCL2增强其招募并活化巨噬细胞、T细胞等免疫效应细胞的能力。与常规BCG相比，rBCG
‑
CCL2高效地诱导免疫应答，提高宿主抗结核天然和特异性的免疫防御功能，促进入侵结核菌的清除，具备实际推广应用价值。
[0019]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0020]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。
附图说明
[0021]图1重组菌株rBCG
‑
CCL2的构建与表达验证((a)：rccl2基因的构建策略示意图；(b)PCR检测BCG
‑
CCL2菌株中的rccl2基因，M：DNA marker DL2000，+：阳性质粒pMV261
‑
ccl2对照，
‑
：无模板对照，p：BCG空载体质粒菌株对照，c：rBCG
‑
CCL2菌株；(c)Western Blot鉴定rCCL2的表达，M：蛋白相对分子质量marker，c：rBCG
‑
CCL2菌体蛋白上清液，NC：BCG空载体质粒菌株蛋白上清液)。
[0022]图2rBCG
‑
CCL2和BCG菌株体外趋化巨噬细胞作用的比较((a)Transwell小室膜的显微照片(结晶紫染色细胞)；(b)穿过Transwell小室膜的巨噬细胞的数量统计，NC为未处理的细胞对照。所示数据用平均值
±
SEM表示，统计方法采用unpaired t
‑
test(n＝7)，**p<0.01)。
[0023]图3流式细胞术分析小鼠肺组织淋巴细胞表型的设门逻辑(箭头指向为设门逻辑方向；首先以前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)圈出目标淋巴细胞群，然后以前向散射光的Area(FSC
‑
A)和Height(FSC
‑
H)参数去除粘连体和细胞碎片，接着用细胞死活染料FVS圈出活细胞(即FSV阴性细胞群)，接着在活细胞群下用F4/80和CD11B双色圈出巨噬细胞(F4/80
+
CD11B
+
)，然后在巨噬细胞门下用CD86和CD206双色圈出巨噬细胞中的M1极化细胞(CD86
+
)和M2极化细胞(CD206
+
)，最后在F4/80和CD11B双阴性的细胞群门下用CD3和CD19圈出T细胞(CD3
+
)和B细胞(CD19
+
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种重组质粒，其特征在于：它是包含权利要求1所述基因的质粒。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述质粒为大肠杆菌
‑
分枝杆菌穿梭质粒载体pMV261。4.一种重组菌，其特征在于：它是包括权利要求1所述基因或者权利要求2
‑
3所述重组质粒的卡介苗菌株。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述卡介苗菌株为牛结核分枝杆菌Mycobacterium bovis BCG str.Pasteur 1173P2...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭绍华，刘杰，欧阳江山，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：