一种草地贪夜蛾的stat基因片段及其dsRNA和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种草地贪夜蛾的stat基因片段及其dsRNA和应用，所述草地贪夜蛾的stat基因片段的序列为SEQ ID No.1，本发明专利技术合成了用于干扰草地贪夜蛾信号转导与转录激活因子STAT的dsRNA(dsstat)，且运用注射法将dsRNA导入草地贪夜蛾对stat进行RNA干扰。dsstat通过降低草地贪夜蛾stat基因的表达量可显著影响草地贪夜蛾的蛹化率、羽化率，导致草地贪夜蛾蜕皮变态发育过程无法正常进行，从而导致昆虫死亡，达到防治草地贪夜蛾的效果，并且在防治过程中，对人畜没有危害，且对环境没有污染。本发明专利技术的双链小分子干扰RNA的靶基因能够显著影响鳞翅目害虫蜕皮及发育，具有潜在的经济和社会效益。会效益。会效益。

【技术实现步骤摘要】
一种草地贪夜蛾的stat基因片段及其dsRNA和应用

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[0001]本专利技术涉及干扰草地贪夜蛾stat基因片段及其dsRNA和应用，属于生物

技术背景：
[0002]microRNA(miRNA)是一类可在转录后水平上调控基因表达的长约22bp的内源性非蛋白质编码RNA，它可以控制基因表达模式，通过与靶基因mRNA的3
’
UTR特异性互补配对从而在转录或转录后水平调控多个靶mRNA的表达。miRNA预计可调节数百个靶标并参与机体凋亡、信号转导、分化、细胞增殖、器官发育、细胞程序性死亡、生物体自身免疫稳态的维持等重要生命过程。miR
‑
34作为近年来广受关注的microRNA，在进化中高度保守。miR
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34可调节多个靶标，参与肿瘤细胞凋亡、信号转导、细胞周期调控、免疫稳态调节、器官发育、机体或器官衰老、调节压力应激反应、精子发生等生物学过程。
[0003]在长期进化过程中，昆虫形成了天然免疫防御系统，即体液免疫和细胞免疫。体液免疫主要包括Toll、IMD和JAK/STAT等信号通路，通过信号转导及免疫途径调控免疫相关基因的表达，诱导产生抗菌肽和其他效应分子。经典的Toll信号通路受到革兰氏阳性菌和真菌侵染时被激活，也可有效抵御病毒和疟原虫。IMD信号通路对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和疟原虫等有害生物的侵染作出免疫应答。JAK/STAT信号通路是脊椎动物和无脊椎动物抵御病毒侵染过程中一条非常重要的通路。我们之前的研究发现草地贪夜蛾中miR
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34
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5p可以靶向JAK/STAT信号通路中的主要基因stat，从而进行草地贪夜蛾抗病毒免疫调节。
[0004]信号转导与转录激活因子(Signal transducer and activator of transcription,STAT)是JAK/STAT信号通路的主要成员之一，在无脊椎动物中普遍保守，主要包括6个结构功能域：N端保守区、DNA结合区、Src同源区(SH3)、Src同源区2(SH2)、酪氨酸磷酸化位点及C端转录活性功能区。该蛋白具有信号转导和转录调控双重功能。为了进一步明确该蛋白的功能，本研究使用RNAi的方法抑制宿主STAT表达，从而进一步分析STAT的功能。

技术实现思路
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[0005]本专利技术的目的在于提供一种草地贪夜蛾的stat基因片段及其dsRNA和应用。该dsRNA可以使草地贪夜蛾出现发育变缓及蜕皮异常死亡的现象，从而达到控制害虫的目的。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007](1)首先以草地贪夜蛾Sf9细胞cDNA为模板克隆获得stat基因序列,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008](2)对草地贪夜蛾stat基因进行设计引物，合成了用于干扰草地贪夜蛾stat基因的dsRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
[0009](3)运用注射法将dsRNA导入草地贪菜蛾对stat基因的转录产物进行RNAi。
[0010](4)观察草地贪夜蛾表型、体重、蛹化率和羽化率变化。
[0011]本专利技术的有益效果：经过抗草地贪夜蛾虫体实验表明，将stat基因表达下调，可显
著影响草地贪夜蛾的蛹化率、羽化率及生长发育。本专利技术的双链小分子干扰RNA可在制备草地贪夜蛾或其他鳞翅目害虫杀虫剂中应用。所述鳞翅目害虫如棉铃虫、玉米夜蛾、甜菜夜蛾等。
附图说明
[0012]图1 dsstat干扰效率分析
[0013]图2 stat沉默对草地贪夜蛾幼虫蜕皮的影响
[0014]图3 stat沉默对草地贪夜蛾蛹的影响
[0015]图4 stat沉默对草地贪夜蛾蛹化率及羽化率的影响
具体实施方式
[0016]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的保护范围。
[0017]以下实施例中所涉及的实验方法，若无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0018]以下实施例中所涉及的试剂耗材和仪器等，若无特殊说明，均为可市售购得的产品。
[0019]实施例1 stat基因片段的克隆方法：
[0020](1)用TRIzol法提取Sf9细胞总RNA；Trizol法提取RNA的步骤：每1ml Trizol溶液中加入200μL氯仿，上下颠倒混匀，室温静置5min；4℃，12000rpm离心15min，取上层水相，再加入500μL的异丙醇，混匀后于室温静置15min；12000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1ml 75％的乙醇(由750μL无水乙醇与250μL的DEPC水配制)，轻轻震荡使沉淀悬浮；4℃，7000rpm离心5min，弃上清，室温干燥7
‑
8min；将RNA溶于适当的DEPC水中，
‑
80℃冰箱保存。
[0021](2)合成cDNA第一条链；
[0022](3)从草地贪夜蛾转录组中获取基因片段序列，设计引物stat
‑
F:5
’‑
CCCTGTGGTGTGATCATCTG
‑3’
(SEQ ID No.3)和stat
‑
R：5
’‑
ATCTGCTCGAACAATTCGCT
‑3’
(SEQ ID No.4)，以PCR方法进行扩增；
[0023](4)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒回收目的片段并测序。
[0024]实施例2 stat表达沉默会影响草地贪夜蛾蜕皮及生长发育
[0025](1)dsRNA合成
[0026]将T7启动子序列加入到特异性引物中，引物序列：stat
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F:5
’‑
TAATACGACTCACTATAGGGCCCTGTGGTGTGATCATCTG
‑3’
(SEQ ID No.5)和stat
‑
R:5
’‑
TAATACGACTCACTATAGGGATCTGCTCGAACAATTCGCT
‑3’
(SEQ ID No.6)，通过PCR扩增用于dsRNA合成的DNA模板，然后用TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit试剂盒合成dsRNA，之后进行dsRNA纯化并检测其完整性。
[0027]dsRNA纯化步骤：
[0028]1)于200μL PCR管中加入2μL DNase，37℃反应15min，加入2μLEDTA溶液，65℃反应10min。
[0029]2)上述反应液中加入115μL的DEPC水和15μL pH5.2的醋酸钠溶液。充分混合。
[0030]3)用1:1pH4.7的苯酚和氯仿等体积混合萃取，再用等体积的氯仿萃取两次，收集水相并转移至新的EP管中。
[0031]4)加入两倍体积的乙醇本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种草地贪夜蛾的stat基因片段，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。2.如权利要求1所述的基因片段的双链小分子干扰RNA，其特征在于，序列如SEQ ID No.2所示。3.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：付月君，王琛，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：