一种人诱导多能干细胞诱导分化建立肝脏类器官的方法技术

本发明专利技术涉及一种人诱导多能干细胞诱导分化建立肝脏类器官的方法。所述方法包括：人多能干细胞培养、定向内胚层的诱导、前肠内胚层的诱导、FG细胞3D扩增及肝脏类器官诱导培养和肝脏类器官成熟。所述方法克服了现有技术的缺点，首先，人诱导多能干细胞可以由人体的血液细胞、皮肤细胞等去分化诱导而来，解决了细胞来源的问题；另外，由于多能干细胞的全能性，由多能干细胞分化来的肝脏类器官可以生成含有多种细胞成分的肝脏类器官，再加上由多能干细胞生成类器官的方案中可以对干细胞进行基因编辑和标记，并可以大批量、标准化进行分化，因此具有广阔的应用前景。此具有广阔的应用前景。此具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种人诱导多能干细胞诱导分化建立肝脏类器官的方法


[0001]本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种人诱导多能干细胞诱导分化建立肝脏类器官的方法。

技术介绍

[0002]肝脏是人体最重要的代谢器官，对于维持人体的生理稳态具有重要作用。肝脏由不同类型细胞的构成，包括实质细胞肝细胞和非实质细胞的胆管细胞、库弗细胞、肝星状细胞等细胞组成。各种原因导致的肝脏疾病已成为全球人类最主要死亡原因之一，因此深入了解肝脏细胞生理功能对于揭示肝脏疾病机制、提供有效治疗方法，就显得十分重要。然而，目前肝脏的研究很大程度上受到肝脏研究模型的制约。人的原代肝细胞不容易获得，而且在体外也无法长期进行培养并维持其细胞结构与功能；大鼠、小鼠等常用于研究肝脏疾病的动物模型由于物种差异，遗传代谢机制与人类有较大的差别，不能反映人类疾病真实情况。因此，迫切需要一种能够反映人体肝脏真实生理功能的肝脏疾病模型进行实验和临床研究。
[0003]现有技术中常以人体肝脏驻留干细胞即成体干细胞(也包括肿瘤细胞)为来源构建肝脏类器官的培养方案，虽然人体肝脏驻留干细胞分化成的肝脏类器官生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人诱导多能干细胞诱导分化建立肝脏类器官的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(I)人多能干细胞培养：(1)、采用mTeSR1培养基，于低生长因子基质胶包被的培养板上培养人诱导多能干细胞，待所述人诱导多能干细胞的细胞密度达到75～85％时，采用Accutase酶消化成单细胞；(2)、将所述单细胞重新接种于另一低生长因子基质胶包被的培养板上，并加入ROCKinhibitor进行培养；(II)定向内胚层的诱导：(S1)、待细胞生长至细胞密度达70～90％时进行分化，弃去mTeSR1培养基，将细胞加入至含有重组人骨形态发生蛋白
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4和重组人激活素A的RPMI1640培养基中进行培养；(S2)、待步骤(S1)培养结束后，弃去步骤(S1)中的培养基，重新加入含有重组人激活素A和血清替代物的RPMI1640培养基继续进行培养；(S3)、待步骤(S2)培养结束后，弃去步骤(S2)中的培养基，重新加入含有重组人激活素A和血清替代物的RPMI1640培养基继续进行培养，直至细胞诱导分化为定向内胚层；(III)前肠内胚层的诱导：弃去步骤(S3)中的培养基，加入添加有重组人成纤维细胞生长因子
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10、CHR99021、血清替代物、非必需氨基酸和青/链霉素双抗的高糖DMEM培养基进行培养，直至诱导为前肠内胚层；(IV)FG细胞3D扩增及肝脏类器官诱导培养：(SS1)、弃去步骤(III)中的培养基，采用Accutase酶消化为单细胞并用基质胶重悬后滴加至培养板中固化，然后加入含有CHR99021、重组人成纤维细胞生长因子
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2、A83
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01、EGF表皮细胞生长因子、血清替代物、非必需氨基酸和青/链霉素双抗的高糖DMEM培养基进行培养；(SS2)、待步骤(SS1)培养结束后，弃去步骤(SS1)中的培养基，然后加入含有CHR99021、重组人成纤维细胞生长因子
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2、A83
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01、EGF表皮细胞生长因子、维甲酸、血清替代物、非必需氨基酸和青/链霉素双抗的高糖DMEM培养基进行培养；(SS3)、待步骤(SS2)培养结束后，弃去步骤(SS2)中的培养基，然后加入含有维甲酸、血清替代物、非必需氨基酸和青/链霉素双抗的高糖DMEM培养基进行培养；(V)肝脏类器官成熟：待分化过程中出现细胞团时，弃去步骤(SS3)中的培养基，然后加入含有地塞米松、重组人肿瘤抑制素M和重组人肝细胞生长因子的肝细胞培养基以诱...

【专利技术属性】
技术研发人员：解军，冯志伟，周冰蕊，穆箭兵，刘志贞，徐钧，魏云亮，王晓玲，帅旗志，黄婷娟，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：