由景深扩展技术优化的数字微流控单细胞分选系统技术方案

本发明专利技术公开了一种由景深扩展技术优化的数字微流控单细胞分选系统；该系统包括基础光学成像系统、数字微流控芯片、光学相位调制器件、控制模块和图像处理模块；基础光学成像系统包括显微镜、sCMOS相机及汞灯系统，其用于获取微流控芯片的显微成像数据；光学相位调制器件以相位板的形式插入显微镜物镜和sCMOS相机镜头的共同焦点处，对光路的相位进行调制，使系统光路z轴轴向归一化PSF强度在较大的景深范围内维持较高水平及平稳状态，减缓其衰减。本发明专利技术系统能以较低的成本解决现有的DMF分选系统中成像景深不足，计数方式存在缺陷的问题，能在单张图像上捕获几乎整个液滴包含的颗粒，提高相关实验分析流程的准确性与稳定性。提高相关实验分析流程的准确性与稳定性。提高相关实验分析流程的准确性与稳定性。

【技术实现步骤摘要】
由景深扩展技术优化的数字微流控单细胞分选系统


[0001]本专利技术涉及数字微流控技术，同时融合了一种光学显微镜景深扩展技术，结合对相关的生物医学数字图像处理。

技术介绍

[0002]在当前的制药颗粒物分析以及生物医学实验的单细胞分选中，传统技术如激光捕获显微解剖、光镊、光阻法往往带有劳动密集、高损耗、效率较低的缺点。作为一种解决方案，以Flowcam为代表的流式分析技术能够有效避免上述缺点，依靠流道内液体的高速成像，并结合特殊微流道设计如原位阻抗阵列等，能够在一定程度上固定住单个细胞或颗粒，对其进行形态学和生长特征的分析。但这种技术中液体的流动依靠压强等因素，无法自由控制，且对单细胞或颗粒的定位也往往局限于特定的尺寸，易造成流道的堵塞；受固定的单细胞仅限于亲代，无法完整地进一步观察菌株群落的生长及分析其性质，且无法自由地废弃杂质。
[0003]因此利用数字微流控(DMF)系统代替上述传统技术，可以在集成设计配方的单个微流控芯片上对所需的单细胞或颗粒进行筛选、培养。但现有以Ahmadi等提出的ID2M为代表的DMF系统设计中由于工艺原因，系统流道高度一般远高于光学显微镜景深大小，造成了“goast
‑
well”问题，即因为成像深度不足导致系统计数时忽略此深度之外的悬浮细胞或颗粒，导致计数值及荧光统计值偏小的问题。
[0004]针对景深的不足，传统做法是拍摄多个轴向图像形成立体全局图像，但光学重聚焦耗费了大量时间，不符合高通量分析的要求。为解决景深扩展问题而新提出的诸多技术中，快速电重聚焦、使用光场测量的数字重聚焦等同样带有上述问题，而使用独立光学器件如菲涅耳透镜、立体相位掩模等扩展景深的方法较为适合高通量成像系统，但这些设备的成本和所造成的图像畸变同样需要被纳入考虑。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于光学相位调制器件优化成像深度的DMF单细胞分选系统，并提供以LR去卷积算法为主的图像去畸变优化算法及单细胞计数、荧光分析算法。本专利技术提供了一种能够对单细胞液滴进行自主筛选、独立培养并提取的培养与分析集成系统，同时能解决本领域传统器件与显微成像系统景深无法匹配，单次成像无法覆盖整个液滴深度的问题，符合系统的高通量高速成像需求。
[0006]本专利技术的技术方案具体介绍如下。
[0007]一种由景深扩展技术优化的数字微流控单细胞分选系统，其包括基础光学成像系统、光学相位调制器件、数字微流控芯片、控制模块和图像处理模块；其中：
[0008]基础光学成像系统，包括倒置显微镜、sCMOS(高科技互补金属氧化物半导体)相机及汞灯系统，其用于获取数字微流控芯片的明场及荧光两模态的显微成像数据；
[0009]光学相位调制器件，以相位板的形式插入基础光学成像系统中的显微镜物镜和
sCMOS相机镜头的共同焦点处，对显微镜物镜进行相位调制，扩展系统成像深度；
[0010]数字微流控平台与芯片，数字微流控平台接收控制模块的微流控控制信号转发给芯片，芯片控制液滴的移动，完成分选、培养、提取的功能；
[0011]控制模块，发送微流控控制信号给数字微流控平台，接收数字微流控平台的反馈信号控制sCMOS相机拍摄信号的触发；
[0012]图像处理模块，对接收到的来自sCMOS相机的明场及荧光图像数据进行后处理，以数值形式输出所统计的单细胞个数、细胞轮廓内部总荧光强度、单个细胞平均荧光强度。
[0013]本专利技术中，汞灯系统包括汞灯光源、激发光滤光片和荧光滤光片；汞灯光源的入射端和激发光滤光片相连，接收端和荧光滤光片相连。
[0014]本专利技术中，数字微流控平台放置在电控位移平台之上，数字微流控平台通过USB接口及自带WiFi信号与控制模块连接，控制模块调用预先存储的动作配方信息，通过方波信号进行液滴在芯片上的电润湿运动控制；芯片上的电极按照阵列排布，被划分为不同功能区域：
[0015]进液区以及与其相连的分液区；
[0016]分选区，用于观察和筛选单细胞液滴、并进行多种溶液混合；
[0017]培养区，用于筛选出的单细胞或颗粒的观察与培养；
[0018]取液区，用于提取所需颗粒和细胞；
[0019]废液区，用于引导分选区中的废液以及阵列中不符合需求的液滴。
[0020]本专利技术中，数字微流控平台与芯片实现分选、培养、提取的功能，具体如下：
[0021](1)分选
[0022]在进液区加入经足量液态培养基稀释的菌株混悬液，在分液区获得液滴在分选区观察点经sCMOS相机拍照分析，如仅识别包含一个单独的细胞颗粒，则经分选区上部电极阵列引导进入培养阵列；如不包含颗粒或包含两个以上颗粒，经分选区下部通道进入废液区；若进液区中液滴被全部分选完毕，则存储于培养阵列中的单细胞进入培养流程；
[0023](2)培养
[0024]培养过程中，引导液滴在培养区观察点电极及其右方电极间来回摇动，使液滴内细胞分布均匀，避免粘附于芯片基底；液滴每隔一段时间被观察拍照一次，进行单细胞数量统计；若满一定时间，在每次明场拍摄完毕后拍摄该液滴的荧光图像，由此进行明场细胞轮廓范围内的荧光产量统计，在培养流程满一定时间后，液滴按逐列左移的形式移出培养阵列进入取液阵列，进入提取流程；
[0025](3)提取流程
[0026]液滴在取液区逐滴下移，若该液滴包含产量最高的克隆，则移出取液口进行下一步培养；若非目标液滴，则将其移入废液区，由此，完成整个流程。
[0027]本专利技术中，菌株混悬液为酿酒酵母混悬液；培养过程中，液滴每隔6小时被观察拍照一次，满24小时，在每次明场拍摄完毕后拍摄液滴的荧光图像；在培养流程满48小时后，液滴按逐列左移的形式移出培养阵列
[0028]本专利技术中，在分选过程中，数字微流控平台与芯片引导液滴上下摇动并拍摄2
‑
3次，降低单颗粒被忽视的概率。
[0029]本专利技术中，图像处理模块对接收到的来自sCMOS相机的明场及荧光图像数据进行
LR去卷积处理，得到去畸变的液滴明场、荧光图像，再将获得的明场图像与预先获取的背景图像相减，经自适应阈值算法处理提取出细胞大致轮廓范围，经形态学处理填充孔洞后进行轮廓识别与提取，统计单细胞个数；明场获得的细胞轮廓内部保存为mask映射至荧光图像，进行荧光强度分析与计算，统计细胞轮廓内部总荧光强度及单细胞平均荧光强度。
[0030]本专利技术中，图像处理模块中，对提取出的面积较小的细胞，为避免粘连情况引起的计算偏差，采用预先统计的细胞平均面积进行数值估算。
[0031]本专利技术中，图像处理模块中，对轮廓较大占10*10pixels以上的颗粒在形态学变换后采用watershed方法进行分离，计算其个数。
[0032]如上所述，本专利技术的由景深扩展技术优化的数字微流控单细胞分选系统，具有以下有益效果：提供了一套完整的可自由操作液滴动作，不受颗粒尺寸与形状影响，融合单细胞分选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种由景深扩展技术优化的数字微流控单细胞分选系统，其特征在于，其包括基础光学成像系统、光学相位调制器件、数字微流控芯片、控制模块和图像处理模块；其中：基础光学成像系统，包括倒置显微镜、sCMOS相机及汞灯系统，其用于获取数字微流控芯片的明场及荧光两模态的显微成像数据；光学相位调制器件，以相位板的形式插入基础光学成像系统中的显微镜物镜和sCMOS相机镜头的共同焦点处，对显微镜物镜进行相位调制，扩展系统成像深度；数字微流控平台与芯片，数字微流控平台接收控制模块的微流控控制信号转发给芯片，芯片控制液滴的移动，实现分选、培养、提取的功能；控制模块，发送微流控控制信号给数字微流控平台，接收数字微流控平台的反馈信号并根据反馈信号控制sCMOS相机拍摄信号的触发；图像处理模块，对接收到的来自sCMOS相机的明场及荧光图像数据进行后处理，以数值形式输出所统计的单细胞个数、细胞轮廓内部总荧光强度、单个细胞平均荧光强度。2.根据权利要求1所述的数字微流控单细胞分选系统，其特征在于，汞灯系统包括汞灯光源、激发光滤光片和荧光滤光片；汞灯光源的入射端和激发光滤光片相连，接收端和荧光滤光片相连。3.根据权利要求1所述的数字微流控单细胞分选系统，其特征在于，相位板对光学显微镜系统光学相位传导起调制作用，其扩展系统成像深度，以在单张图像上捕获几乎整个液滴包含的颗粒；其根据公式1）设计：式1）其中：Φ(ρ)代表调制器添加到距中心点ρ处的相位，ρ代表同一个z值所属x
‑
y平面上点到中心的距离即，δ为所需设计的相位调制景深，f为物镜焦距，ρ
max
表示相位板光瞳平面上可以传导光线的最大半径，C表示一个用于补偿的常数项，λ表示该系统工作波段的中心波长。4.根据权利要求1所述的数字微流控单细胞分选系统，其特征在于，数字微流控平台放置在电控位移平台之上，数字微流控平台通过USB接口及自带WiFi信号与控制模块连接，控制模块调用预先存储的动作配方信息，通过方波信号进行液滴在芯片上的电润湿运动控制；芯片上的电极按照阵列排布，被划分为不同功能区域：进液区以及与其相连的分液区；分选区，用于观察和筛选单细胞液滴、并进行多种溶液混合；培养区，用于筛选出的单细胞或颗粒的观察与培养；取液区，用于提取所需颗粒和细胞；废液区，用于引导分选区中的废液以及阵列中不符合需求的液滴。5.根据权利要求4所述的数字微流控单细胞分选系统，其特征在于，数字微流控平台与芯片实现分选、培养、提取的功能，具体如下：（1）分选
在进液区加入经足量液态培养基稀释的菌株混悬液，在分液区...

【专利技术属性】
技术研发人员：马炯，陈秋澍，刘毓哲，龙相安，陈丽雯，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：