一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法，包括：根据SNP位点Nk设计两条上游引物，同时在SNP每个位点Nk下游段设计一条通用反向引物；分别配制P1、P2亲本类型的多重引物反应体系X1、X2，X1和X2同P1、P2及后代个体模板最终配制成PCR反应体系；用亲本P1、P2、及10

【技术实现步骤摘要】
一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法及应用。

技术介绍

[0002]随着测序技术的发展，测序的成本越来越低，测序可以获得大量的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点以及插入缺失(Insertion
‑
deletion InDel)位点，基于SNP/InDel开发分子标记较SSR等常规的分子标记数量、密度要高很多，为育种家进行开发和目标性状紧密连锁的分子标记以及对目标基因的进行精细定位提供了可能性，然而常见的CAPS标记依赖酶切，受酶切位点的限制，dCAPS需要借助聚丙烯酰胺胶进行分型，KASP可实现高通量分型，但所需的荧光引物合成贵，而且分析需要借助专门的荧光PCR仪器，也限制了实验室条件一般的科技人员的使用。基于测序的多重PCR技术的高通量SNP标记可以同时进行多个标记分型，但需要依赖测序。本研究旨在结合KASP标记和多重PCR技术优点，开发一种多重简单KASP分子标记：多重简单竞争性等位基因特异性PCR技术(Multiplex Simple Kompetitive Allele Specific PCR MSKASP)，该方法不需要依赖昂贵的仪器，也不需要依赖测序，仅需要普通的PCR仪以及琼脂糖电泳即可达到对个体基因型分型的目的，不仅节约成本，而且操作简单方便，更适合小型实验室使用，同时也可以实现高通量的目标。
专利技术内容
[0003]本专利技术的目的在于提供一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法及应用，该方法不需要依赖昂贵的仪器，也不需要依赖测序，仅需要普通的PCR仪以及琼脂糖电泳即可达到对个体基因型分型的目的。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供了一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法，包括以下步骤：
[0005](1)根据SNP不同位点Nk设计上游引物，每个位点设计两条上游引物，一条引物序列的末端与其中显性亲本P1位点序列相同，记作PrimerNkF1；一条引物序列的末端同隐性亲本P2位点序列相同，记作PrimerNkF2；同时在SNP每个位点Nk下游段设计一条条通用反向引物，记作PrimerNkR；引物对PrimerNkF1和PrimerNkR作为标记P1亲本第Nk个SNP位点基因型的引物，记作PriNkP1；引物对PrimerNkF2和PrimerNkR作为标记P2亲本第Nk个SNP位点基因型的引物，记作PriNkP2；
[0006](2)利用两个亲本P1和P2的模板，以及两个亲本的F1代对步骤(1)设计的引物进行验证；
[0007](3)用亲本P1、P2、及10
‑
20个P1和P2衍生的后代个体(已经确定每个后代个体SNP位点基因型)进行多重PCR验证：分别配制P1、P2亲本类型的多重引物反应体系，用P1亲本类型的引物对配制P1类型的多重PCR扩增体系X1；用P2亲本类型的引物对配制P2类型多重引
物反应体系X2；X1和X2同P1、P2及后代个体模板最终配制成PCR反应体系；
[0008](4)把步骤(3)扩增完成的反应体系用1％的琼脂糖胶进行电泳分型，满足以下条件可进一步用于P1和P2后代个体基因型的鉴定：多重体系X1基因分型结果为分型P1出来i条清晰可见的带，片段大小和每条引物测试P1时的结果能一一对应，分型P2不出带，分型F1和P1结果一致；多重体系X2基因分型结果为分型P2出来i条清晰可见的带，片段大小和每条引物测试P2时的结果能一一对应，分型P1不出带，分型F1和P2结果一致；
[0009](5)利用X1和X2对亲本P1和P2杂交所得的后代个体进行基因分型，将X1和X2同亲本P1和P2杂交所得的后代个体模板配制成PCR反应体系，用1％的琼脂糖胶进行电泳分型，判定标准为：
[0010]若X1基因分型有带，X2基因分型无带，则为P1的基因型个体；
[0011]若X1基因分型无带，X2基因分型有带，则为P2的基因型个体；
[0012]若X1基因分型有带，X2基因分型有带，则为杂合基因型个体；
[0013]具体可以将每个个体i位点的基因型表示方式为xy，其中x代表X1分型的基因型，值为0或者1，0代表无带，1代表有带；y代表X2分型的基因型，值为0或者1，0代表无带，1代表有带。分型结果为10、01、11分别代表P1的基因型个体、P2的基因型个体、杂合基因型个体，基因型分别表示为2、0、1。
[0014]优选的，上述简单多重KASP基因分型方法中，所述步骤(1)中，引物设计满足以下条件：
[0015]A1.每个引物退火温度相差在
±
2℃内；
[0016]A2.N1
‑
Nk个标记扩增出来的目标片段大小不同，以有利于用琼脂糖电泳区分为宜；
[0017]A3.引物序列之间不存在容易形成引物二聚体的结构。
[0018]优选的，上述简单多重KASP基因分型方法中，所述步骤(2)中，验证引物能够：每对引物不存在非特异性扩增，且扩增清晰；PriNkP1引物扩增亲本P1模板能出带，扩增亲本P2不能出带；PriNkP2引物扩增亲本P2模板能出带，扩增亲本P1模板不出带；PriNkP1和PriNkP2扩增F1模板均能出带。
[0019]优选的，上述简单多重KASP基因分型方法中，所述步骤(3)中，配制PCR反应体系时，可先按照i/1ul的量加入i对引物混合(25ul反应体系)，如果扩增效果不佳，再调试引物浓度及其他反应体系条件；用来混合用的每对引物扩增出来的片段大小不同，且容易通过琼脂糖电泳分辨。
[0020]上述的简单多重KASP基因分型方法在农作物育种中的应用。
[0021]优选的，上述的应用，对蛋白含量高的植物种子快提的DNA模板进行分型，按照上述的基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法进行分型，在播种前每一粒种子的基因型，筛选符合需求的种子进行种植。
[0022]本专利技术还提供一种大豆黄叶基因的分型方法，采用上述的简单多重KASP基因分型方法，具体包括：使用的两组引物对待测大豆的DNA模板进行多重PCR扩增，扩增完成的反应体系用1％的琼脂糖胶进行电泳分型；所述两组引物对为：引物对PrimerN2YL，上游引物的核苷酸序列是SEQ ID NO:1：CGGAGAGGAGATAATGGTAAC，下游引物的核苷酸序列是SEQ ID NO:2：TTGATCCAAGCACGCAATA；引物对PrimerN2GC8：上游引物的核苷酸序列是SEQ ID NO:3：
CGGAGAGGAGATAATGGTAAG，下游引物的核苷酸序列是SEQ ID NO:2：TTGATCCAAGCACGCAATA所示。
[0023]优选的，上述大豆黄叶基因的分型方法中，评判标准为：
[0024]引物对PrimerN2YL对应分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于SNP位点的简单多重KASP基因分型方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据SNP不同位点Nk设计上游引物，每个位点设计两条上游引物，一条引物序列的末端与其中显性亲本P1位点序列相同，记作PrimerNkF1；一条引物序列的末端同隐性亲本P2位点序列相同，记作PrimerNkF2；同时在SNP每个位点Nk下游段设计一条通用反向引物，记作PrimerNkR；引物对PrimerNkF1和PrimerNkR作为标记P1亲本第Nk个SNP位点基因型的引物，记作PriNkP1；引物对PrimerNkF2和PrimerNkR作为标记P2亲本第Nk个SNP位点基因型的引物，记作PriNkP2；（2）利用两个亲本P1和P2的模板，以及两个亲本的F1代对步骤（1）设计的引物进行验证；（3）用亲本P1、P2、及10
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20个P1和P2衍生的后代个体进行多重PCR验证：分别配制P1、P2亲本类型的多重引物反应体系，用P1亲本类型的引物对配制P1类型的多重PCR扩增体系X1；用P2亲本类型的引物对配制P2类型多重引物反应体系X2；X1和X2同P1、P2及后代个体模板最终配制成PCR反应体系；（4）把步骤（3）扩增完成的反应体系用1%的琼脂糖胶进行电泳分型，满足以下条件可进一步用于P1和P2后代个体基因型的鉴定：多重体系X1基因分型结果为分型P1出带，分型P2不出带，分型F1和P1结果一致；多重体系X2基因分型结果为分型P2出带，分型P1不出带，分型F1和P2结果一致；（5）利用X1和X2对亲本P1和P2杂交所得的后代个体进行基因分型，将X1和X2同亲本P1和P2杂交所得的后代个体模板配制成PCR反应体系，用1%的琼脂糖胶进行电泳分型，判定标准为：若X1基因分型有带，X2基因分型无带，则为P1的基因型个体；若X1基因分型无带，X2基因分型有带，则为P2的基因型个体；若X1基因分型有带，X2基因分型有带，则为杂合基因型个体。2.根据权利要求1所述的简单多重KASP基因分型方法，其特征在于，所述步骤（1）中，引物设计满足以下条件：A1.每个引物退火温度相差在
±
2℃内；A2.N1
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Nk个标记扩增出来的目标片段大小不同，以有利于用琼脂糖电泳区分为宜；A3.引物序列之间不存在容易形成引物二聚体的结构。3.根据权利要求1所述的简单多重KASP基因分型方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文杰，宁德娇，梁江，韦清源，汤复跃，郭小红，陈渊，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：