一种湿证动物模型的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种湿证动物模型的制备方法。本发明专利技术所述湿证动物模型的建立方法包括采用白色念珠菌、大肠杆菌等致病微生物进行腹腔注射的方法建立湿证动物模型。采用上述方法制作的湿证动物模型，在6～12小时内即可出现湿证的典型症候即大便黏腻，四肢懈怠，造模成功率100％。采用上述方法制作的湿证动物模型的表现与临床上湿证表现极其相似，该动物模型简单有效，制备时间短，可重复性强，且可有效表征湿证的症状。采用上述方法制作的湿证动物模型可用于湿证的机理及其干预治疗的研究。对进一步深入探讨相关中医病证的机理及其干预治疗研究创造条件。研究创造条件。研究创造条件。

【技术实现步骤摘要】
一种湿证动物模型的制备方法


[0001]本专利技术属于动物模型
，具体涉及一种湿证动物模型的建立方法。

技术介绍

[0002]湿证是中医病证名，中医认为湿生百病。因湿性重着、粘滞、易阻碍气机，损伤阳气，故其病变常缠绵留着，不易速去。其症候特点为头胀而痛，脘腹满闷，身重而痛，体倦，舌苔黏腻，脉缓或濡。湿证可分为内湿和外湿，内湿主要因摄食太多肥甘生湿食物，超过脾运化的负荷；外湿主要来源于感受外界环境中的湿邪。内湿和外湿可相互影响，说明内外湿有共同的发病机制。按现代研究，无论内湿外湿，均离不开致病微生物。内湿产生，是因为肥甘生湿食物滋助了肠道内致病微生物的定植、繁殖。外湿的产生，是因为空气或水源中致病微生物侵袭人体呼吸道、消化道粘膜。
[0003]湿证牵涉到几乎所有的疾病的发生发展，中医对湿证有较详细的症候描述和中医传统术语机制分析，创造了许多治疗湿证的方药，但仍未能清晰阐述湿证特定的病理生理机制，未能获得现代医学的承认。一个重要的原因是还没有一种便捷模拟湿证的症候表现的模型动物，制约了对湿证的病理机制的深入理解，和评价湿证相关新药或干预措施的效果及机制。
[0004]目前使用最多的湿证小鼠模型造模，以人工候箱加高脂饲料，维持湿度在95％以上，持续20天以上。但因为小鼠个体差异大，有些小鼠并不成模，或离开高湿环境，在数日内恢复正常。有研究在高湿环境和高脂饲料基础上，增加了灌服一定含量的酒或乙醇，前10d予以大鼠高脂饲料，并隔日灌服白酒(10mL/kg),再将大鼠放置于模拟高温高湿环境的人工气候箱中。有研究在高湿环境和高脂饲料基础上，增加了灌大肠杆菌或沙门氏菌。给予大鼠高脂高糖养10d,再放入高温、高湿环境中,于96、120h后灌胃鼠伤寒沙门氏菌,然后移出至自然环境。结果主要症状及体征、发病条件等均近似于中医湿热证型。上述湿证制备方法的繁琐，且条件不统一，制约了湿证机理的研究、湿证动物模型的推广。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的主要目的在于提供一种湿证动物模型的制备方法。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案来实现的：
[0007]一种湿证动物模型的制备方法，包括如下步骤：
[0008](1)在培养基中培养微生物，离心得到菌体，重悬得到菌体悬液备用；
[0009](2)准备健康实验动物，腹腔注射菌体悬液；
[0010](3)检测实验动物的活动度、大便黏腻程度以及血液中的免疫炎症因子的水平，判断湿证模型是否建立成功。
[0011]步骤(1)中所述的微生物为致病或条件致病微生物；优选为包括白色念珠菌(Candida albicans)、大肠杆菌(Esherichia coli)或K.pintolopesii中的至少一种；更优
选为白色念珠菌。
[0012]当步骤(1)中所述的微生物为真菌时，培养基为YM培养基，当所述微生物为细菌时，培养基为LB培养基。
[0013]步骤(1)中所述的培养的条件为35～39℃培养20～30h；优选为37℃培养24h。
[0014]步骤(1)中所述的离心为3000～7000r/min离心5～15min；优选为6000r/min离心10min。
[0015]步骤(1)中所述的重悬为使用无菌PBS重悬。
[0016]步骤(2)中所述的实验动物为C57BJ/6小鼠、KM小鼠和SD大鼠中的至少一种。
[0017]步骤(2)中所述的腹腔注射为根据实验动物的体重，按0.8～3
×
106CFU/g的菌体量进行注射。
[0018]步骤(2)中所述的实验动物分为实验组和对照组。
[0019]步骤(3)中所述的免疫炎症因子包括IL
‑
17A和TNF
‑
α中的至少一种；优选为IL
‑
17A和TNF
‑
α。
[0020]步骤(3)中所述的大便黏腻程度的测定方法具体包括如下步骤：
[0021]将相同质量的粪便放于滤纸上，再加一层滤纸，滤纸上放50克砝码，2分钟后撤去法码，观察上层滤纸上粘有粪便痕迹的面积，测量直径，以直径值大小代表粪便黏湿度。
[0022]步骤(3)中所述的判断湿证模型的方法为当实验组中的动物相较对照组中活动度下降，大便黏腻程度测试的直径超过对照组的50％以上，且动物血液中免疫炎症因子较正常组升高50％以上时，则证明湿证模型建立成功。
[0023]所述的湿证动物模型的制备方法在湿证的评价和分析中的应用。
[0024]本专利技术相对于现有技术具有如下的效果：
[0025]采用本专利技术制作的湿证动物模型的表现与临床上湿证的表现极其相似，以公认的3个评判标准：活动度下降、大便黏腻、血液中免疫炎因子升高为依据，本专利技术的造模方法，成功率100％。
[0026]且原有文献记载的造模方法耗时长，操作繁琐，可重复性差。本专利技术对进一步深入探讨相关中医病证的机理及其干预治疗研究创造条件。
[0027]相对于现有技术，本专利技术具有以下优点：
[0028](1)采用上述方法制作的湿证动物模型，在6～12小时内即出现四肢懈怠，大便黏腻的湿证症候，建模成功率100％；
[0029](2)采用上述方法制作的湿证动物模型的表现与临床上湿证的表现极其相似，而湿证动物模型本身不具有这些表现，故该模型可以认为是一种湿证模型的新专利技术；
[0030](3)本专利技术的湿证动物模型的建立方法的技术特点是基于肠菌异位引发免疫细胞激活，大量释放致粘致炎因子的机理的基础上，快速制备湿证动物模型。对进一步深入探讨相关中医病证的机理及其干预治疗研究创造条件。
附图说明
[0031]图1是实施例1中C57BL/6小鼠进行腹腔注射菌种8h的粪便性状照片图。
[0032]图2是实施例2中正常和注射白色念珠菌后KM小鼠大便外观对比图。
[0033]图3是实施例2中注射白色念珠菌后小鼠血液炎症因子TNF
‑
α和IL
‑
17的结果图。
[0034]图4是实施例4中白色念珠菌对巨噬细胞RAW264.7的影响结果图。
[0035]图5是实施例5中SD大鼠进行腹腔注射菌种6h后粪便性状照片图。
[0036]图6是实施例6中造模后小鼠粪便形态的变化照片图。
[0037]图7是实施例6中造模后小鼠血清的IL
‑
17A含量的变化图。
具体实施方式
[0038]下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0039]下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
[0040]实施例中使用的SD大鼠和KM小鼠均购于广州中医药大学实验动物中心。
[0041]实施例1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种湿证动物模型的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在培养基中培养微生物，离心得到菌体，重悬得到菌体悬液备用；(2)准备健康实验动物，腹腔注射菌体悬液；(3)检测实验动物的活动度、大便黏腻程度以及血液中的免疫炎症因子的水平，判断湿证模型是否建立成功。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的微生物为致病或条件致病微生物。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的微生物为真菌时，培养基为YM培养基；步骤(1)中所述的微生物为细菌时，培养基为LB培养基。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的微生物包括白色念珠菌、大肠杆菌或K.pintolopesii中的至少一种。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的培养的条件为35～39℃培养20～30h；步骤(1)中所述的离心为3000～7000r/min离心5～15min；；步骤(1)中所述的重悬为使用无菌PBS重悬。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的实验动物为C57BJ/6小鼠、KM小鼠和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王剑，郭殷锐，邱灵燕，
申请(专利权)人：广州中医药大学广州中医药研究院，
类型：发明
国别省市：