一种提高植物中咖啡酸、牛奶树碱含量和/或生物发光强度的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高植物中咖啡酸、牛奶树碱含量和/或生物发光强度的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术解析植物中咖啡酸合成途径，通过遗传操作增强植物内源的咖啡酸和牛奶树碱的合成途径，具体的，通过基因工程手段在植物体内整合CM1基因、PAT基因、ADT2基因、PAL1基因、C4H基因、4CL1基因，多基因共表达显著提升植物咖啡酸和牛奶树碱的合成，并将该咖啡酸合成途径和植物自发光途径耦合，可以创造出生物自发光亮度更强的植物。本发明专利技术为高咖啡酸和牛奶树碱含量的植物以及可持续发光植物的育种和生产提供了一个可行的技术方案。和生产提供了一个可行的技术方案。和生产提供了一个可行的技术方案。

【技术实现步骤摘要】
一种提高植物中咖啡酸、牛奶树碱含量和/或生物发光强度的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种利用CM1、PAT、ADT2、PAL1、C4H、4CL1基因的共表达以提高植物咖啡酸(caffeic acid)、牛奶树碱(hispidin)含量和/或生物自发光强度的方法。

技术介绍

[0002]生物发光(Bioluminescence)是生物学研究中用来指示基因表达和蛋白定位的一种常用方法。Kotlobay等2018年报道了一个真菌生物发光的代谢途径(fungal bioluminescence pathway，FBP)，该途径可以将咖啡酸转化为萤光素分子，萤光素酶Luz则可以直接氧化萤光素产生生物发光信号，并鉴定了参与FBP途径的关键酶，真菌荧光素酶(Luz)、hispidin合酶(HispS)、hispidin3
‑
羟化酶(H3H)和咖啡酰丙酮酸水解酶(CPH)，CPH对于自发光的产生不是必需的，但会显著延长发光信号，从而阐明了真菌荧光素的生物合成循环以及发光机制(Kotlobay et al.,2018)。
[0003]Khakhar A等将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因组中的NPGA(4
’‑
phosphopantetheinyl transferase)基因、光茸菌(Neonothopanus nambi)基因组中的H3H(hispidin
‑3‑
hydroxylase)基因和Hisps(Hispidin synthase)基因，以及真菌荧光素酶(Luz)基因整合到Moclo质粒中，再将质粒导入根瘤农杆菌(A.tumefaciens)中，并与经过预处理的茎外植体进行混合培养，将生物自发光元件整合入植株基因组中。该植株自发光机制为：植株体内来自苯丙氨酸生物合成途径的咖啡酸经Hisps蛋白酶激活后转化为牛奶树碱，牛奶树碱经牛奶树碱3
‑
羟基化酶(H3H)催化产生3
‑
羟基牛奶树碱(3
‑
hydroxyhispidin)，荧光素酶(Luz)会将3
‑
羟基牛奶树碱氧化成荧光素3
‑
羟基牛奶树碱，荧光素3
‑
羟基牛奶树碱在释放能量变成咖啡酰丙酮酸(caffeylpyruvic acid)的过程中会释放出波长在520nm的可见光。随后，CPH(Caffey pyruvate hydrolase)编码的蛋白酶将咖啡酰丙酮酸转化成咖啡酸，从而实现植物自发光循环，使植物持续产生光(Mitiouchkina etal.,2020)。
[0004]上述系统可以开发出应用于生物大分子检测的工具，但目前该发光系统在植物中发光较弱，严重影响了该发光系统的广泛应用。研究发现影响该发光强度最关键的物质是咖啡酸和牛奶树碱，因此，如何在植物中提高咖啡酸和牛奶树碱的含量，是提高植物发光强度的重要解决方案。
[0005]另外，咖啡酸广泛存在于植物体内，作为一种多酚类物质具有非常高的生物活性，可以有效去除自由基，具有良好的抗氧化活性，和预防心脑血管疾病，可以作为饮品添加剂，也可以用作原料药。牛奶树碱具有很强的抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗痴呆作用。通过遗传操作增强植物内源的咖啡酸和牛奶树碱的合成途径，提高植物中的咖啡酸和牛奶树碱的含量，用于提取咖啡酸和牛奶树碱，在化工和医药、食品中有重要作用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种能够提升植物内源咖啡酸和牛奶树碱含量，或者增强植物生物自发光强度的方法，将其应用到提高咖啡酸和牛奶树碱含量的植物培育或是增强生物自发光的植物培育中。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术提供了多基因共表达在提高植物中咖啡酸、牛奶树碱含量和/或提高植物生物发光强度中的应用，所述基因包括：CM1基因、PAT基因、ADT2基因、PAL1基因和C4H基因，还包括4CL1基因，所述4CL1基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。
[0009]所述CM1基因编码分支酸变位酶(chorismate mutase)；所述PAT基因编码预苯酸转氨酶(prephenate aminotransferase)；所述ADT2基因编码阿罗酸脱水酶(Arogenate dehydratase 2)；所述PAL1基因编码苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia
‑
lyase)；所述C4H基因编码肉桂酸4
‑
羟化酶(Cinnamate 4
‑
hydroxylase)；所述4CL1基因编码辅酶A连接酶(4
‑
coumarate：coenzyme A ligase)，该蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]通过基因工程手段整合CM1基因、PAT基因、ADT2基因、PAL1基因和C4H基因使其在植物体内共表达，可显著提高植物中咖啡酸含量。本专利技术在此基础上进一步整合了4CL1基因，其编码的蛋白酶参与咖啡酸和牛奶树碱合成途径，可进一步提高植物中咖啡酸和牛奶树碱含量。
[0011]咖啡酸和牛奶树碱作为生物自发光代谢途径中的前体物，其含量增加有助于增强自发光植株的生物自发光强度，研究表明，相较于由Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因整合入植株基因组中获得的自发光植株，经过第二轮转基因进一步整合CM1，PAT，ADT2，PAL1，C4H、4CL1基因可以显著提高植物自发光强度。
[0012]进一步的，所述CM1基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示，所述PAT基因的编码序列如SEQ ID NO.4所示，所述ADT2基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示，所述PAL1基因的编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述C4H基因的编码序列如SEQ ID NO.7所示。
[0013]进一步的，所述应用包括：利用生物学技术手段使得所述基因在植物体内过表达，获得促进咖啡酸、牛奶树碱合成的转基因植株；
[0014]或者利用生物学技术手段使得所述基因在生物自发光受体植株中过表达，获得生物发光强度增强的转基因植株。
[0015]进一步的，所述植物为烟草、油菜、水稻、蝴蝶兰或菊花。
[0016]本专利技术还提供了一种提高植物中咖啡酸、牛奶树碱含量和/或提高植物生物发光强度的方法，包括以下步骤：
[0017](1)利用多基因组装技术将所述的CM1基因、PAT基因、ADT2基因、PAL1基因、C4H基因和4CL1基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；
[0018](2)利用转基因技术将多基因载体中的目标基因片段导入受体植株或生物自发光受体植株中，培育，获得促进咖啡酸、牛奶树碱合成或生物自发光强度增强的转基因植株。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多基因共表达在提高植物中咖啡酸、牛奶树碱含量和/或提高植物生物发光强度中的应用，所述基因包括：CM1基因、PAT基因、ADT2基因、PAL1基因和C4H基因，其特征在于，还包括4CL1基因，所述4CL1基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CM1基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示，所述PAT基因的编码序列如SEQ ID NO.4所示，所述ADT2基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示，所述PAL1基因的编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述C4H基因的编码序列如SEQ ID NO.7所示。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用生物学技术手段使得所述基因在植物体内过表达，获得促进咖啡酸、牛奶树碱合成的转基因植株；或者利用生物学技术手段使得所述基因在生物自发光受体植株中过表达，获得生物发光强度增强的转基因植株。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草、油菜、水稻、蝴蝶兰或菊花。5.一种提高植物中咖啡酸、牛奶树碱含量和/或提高植物生物发光强度的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用多基因组装技术将权利要求1或2中所述的CM1基因、PAT基因、ADT2基因、PAL1基因、C4H基因和4CL1基因整合到受体载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：都浩，李威，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：