一种细胞色素P450突变酶及重组菌、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞色素P450突变酶及重组菌、制备方法及应用，属于生物技术领域。本发明专利技术的重组菌是以CYP154C2(M191F/V285L)突变酶基因与还原伴侣RhFRED基因共表达载体，在大肠杆菌中表达；经过培养后，利用静息细胞法喂养底物睾酮、雄烯二酮进行生物转化，获得2α位羟基化产物。本发明专利技术的细胞色素P450突变酶及重组菌具有严格的区域选择性和立体选择性，产生单一产物。转化睾酮和雄烯二酮的转化率较野生型提高了近10倍，提高了原料和能源利用率，降低了2α

【技术实现步骤摘要】
一种细胞色素P450突变酶及重组菌、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于合成生物
，尤其涉及使用一种细胞色素P450酶合成2α
‑
羟基化甾体化合物的技术，具体而言，是使用细胞色素P450酶CYP154C2
(M191F/V285L)
突变体与还原伴侣RhFRED的共表达重组菌进行生物转化获得2α
‑
羟基睾酮和2α
‑
羟基雄烯二酮等2α
‑
羟基甾体化合物的技术。

技术介绍

[0002]生物催化剂细胞色素P450相比于化学催化剂而言，其具有许多后者不可比拟的优势，例如，细胞色素P450酶能够在相对温和的条件下对化合物中尚未活化的碳氢键进行催化，在选择性方面其具有十分严格的区域选择性和立体选择性，在精细化学品和药物的合成领域具有广阔的应用前景。在DNA测序技术飞速发展的今天，海量的微生物基因组测序数据不断增加并积累，寻找那些尚未被发现的具有工业应用价值的P450酶逐渐成为焦点。已有如氢化可的松，普伐他汀等药物中间体及药物通过P450酶催化合成的成功工业化案例使得人们对P450酶能催化更多不同种类的药物工业合成更具信心。
[0003]甾体类药物是当前临床应用药物中仅次于抗生素的第二大类药物，大部分甾体类药物是对天然甾体化合物进行结构修饰而获得的具有新生物活性的化合物。对甾体化合物的结构修饰反应包括去饱和、醇氧化、环断裂、环氧化等。对甾体类化合物的结构修饰可能会使得化合物的物化性质和药物性质发生重大的改变。诸如，新型泼尼松衍生物15β，17，20β，21
‑
四羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3，11
‑
二酮和15β，17，20β，21
‑
四羟基孕甾
‑
1，4
‑
二烯
‑
3，11
‑
二酮以及15β
‑
羟基化变体都是药物设计和方法开发中极具潜力的候选药物。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种细胞色素P450突变酶及重组菌、制备方法，及利用细胞色素P450突变酶合成2α
‑
羟基化甾体类化合物的应用。
[0005]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006]一种细胞色素P450突变酶，所述细胞色素P450突变酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]一种包含所述细胞色素P450突变酶的重组菌。
[0008]进一步地，重组菌通过如下方法制备获得：
[0009]利用无缝克隆技术从pET28b
‑
CYP154C2
‑
RhFRED(专利号:CN110885868B)中克隆出不含有His标签的CYP154C2
‑
RhFRED基因并导入pET28a的NcoⅠ和XhoⅠ之间获得pET28a
‑
CYP154C2
‑
RhFRED，利用定点突变技术分别突变M191F和V285L获得pET28a
‑
CYP154C2
(M191F/V285L)
‑
RhFRED。将所述质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)，构建获得重组菌。所述pET28a的基因序列如SEQ ID NO.1所示，pET28a
‑
CYP154C2
(M191F/V285L)
‑
RhFRED基因序列如SEQ ID NO.2所示，其中CYP154C2
(M191F/V285L)
基因序列如SEQ ID NO.3所示，RhFRED基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]一种所述重组菌在合成2α
‑
羟基化甾体类化合物中的应用。
[0011]进一步地，所述应用具体为：
[0012]扩大培养重组菌至菌液OD
600
值达到0.8及以上，加入IPTG和5
‑
氨基乙酰丙酸盐诱导菌体表达蛋白，同时将温度降低至22℃，继续培养20h，离心收集菌体；
[0013]将收集的菌体悬浮在50mM磷酸盐缓冲液中，保持pH为7.4，加入甾体类底物进行生物转化，在25℃振荡反应，对发酵液进行提取、分离，得到2
‑
羟基化甾体类化合物。
[0014]进一步地，所述IPTG在TB培养基中的终浓度为0.1mM，所述5
‑
氨基乙酰丙酸盐在TB培养基中的浓度为0.5mM。
[0015]进一步地，所述底物在磷酸缓冲液中的浓度为100μM，所述底物为睾酮或雄烯二酮等甾体类化合物。
[0016]进一步地，磷酸缓冲液由终浓度为50mM的磷酸盐(pH＝7.4)和甘油组成，甘油体积为所述磷酸缓冲液的10％。
[0017]进一步地，所述底物为睾酮，经生物转化，得到的2
‑
羟基化甾体类化合物为2α
‑
羟基睾酮。
[0018]进一步地，所述底物为雄烯二酮，经生物转化，得到的2
‑
羟基化甾体类化合物为2α
‑
羟基雄烯二酮。
[0019]本专利技术的优势及创新点是：
①
本专利技术涉及的CYP154C2
(M191F/V285L)
为未公开的新酶，其重组菌可使睾酮及雄烯二酮等甾体类化合物高效转化为2α位羟基化产物，这些产物目前在工业上主要使用化学合成方法进行制备；
②
CYP154C2
(M191F/V285L)
酶对甾体类化合物具有严格的区域选择性和立体选择性，其仅生产2α位羟基甾体，无其他异构体的产生可提高分离效率；
③
本专利技术制备的催化反应体系可以在温和条件下进行选择性的氧化反应，相比于具有更加复杂工艺流程的传统化学反应，其在生物药物合成领域具有非常广阔的应用前景；
④
利用重组菌的生物转化可显著减少副反应产物，易于分离出目的产物，从而达到高效率。
⑤
本专利技术构建的催化体系对特定的甾体类化合物转化效率较高，对睾酮和雄烯二酮这两种甾体化合物的2α位羟基化转化率相比于野生型提高了近十倍，极大提高了原料和能源利用效率，能产生较为客观的经济效益。
附图说明
[0020]图1为CYP154C2
(M191F/V285L)
与底物生物转化的流程图；
[0021]图2为实验产物的HPLC图谱，其中图2A为实施例1，图2B为实施例2；
具体实施方式
[0022]以下结合实施例详细对本专利技术作进一步地说明。实施方案为便于更好的理解本专利技术，但并非对本专利技术的限制。
[0023]实施例1
[0024]图1为CYP154C2
(M191F/V285L)
与底物生物转化的流程图，具体包括如下步骤：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞色素P450突变酶，其特征在于，所述细胞色素P450突变酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种包含权利要求1所述细胞色素P450突变酶的重组菌。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，通过如下方法制备获得：将CYP154C2
‑
RhFRED基因导入pET28a质粒获得pET28a
‑
CYP154C2
‑
RhFRED，利用定点突变技术分别突变M191F和V285L获得pET28a
‑
CYP154C2
(M191F/V285L)
‑
RhFRED；将pET28a
‑
CYP154C2
(M191F/V285L)
‑
RhFRED质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组菌；其中，所述pET28a质粒的基因序列如SEQ ID NO.1所示，pET28a
‑
CYP154C2
(M191F/V285L)
‑
RhFRED基因序列如SEQ ID NO.2所示，CYP154C2
(M191F/V285L)
基因序列如SEQ ID NO.3所示，RhFRED基因序列如SEQ ID NO.4所示。4.一种权利要求2
‑
3任一项所述重组菌在合成2α
‑
羟基化甾体类化合物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：扩大培...

【专利技术属性】
技术研发人员：许莲花，赖刚，高齐霖，杨建，林润豪，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：