重组T细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用制造技术

本发明专利技术公开了重组T细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用，该重组T细胞的细胞膜表面修饰有如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.04所示的SARS

【技术实现步骤摘要】
重组T细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用


[0001]本专利技术属于冠状病毒药物筛选
，具体涉及重组T细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用。

技术介绍

[0002]人类冠状病毒是一类带有囊膜的正义RNA病毒，可引起人类高致病性疾病，临床症状表现为从轻微的普通感冒到急性呼吸窘迫综合症和死亡。过去二十年爆发的三种高致病性人类冠状病毒：严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS
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CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS)和SARS
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CoV
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2，展现了人类冠状病毒的大流行潜力。SARS
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CoV
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2可以引起上、下呼吸道感染，常伴有发热、咳嗽和嗅觉和味觉丧失，而部分患者出现了更严重的症状，包括全身性炎症、组织损伤、急性呼吸窘迫综合征、血栓栓塞并发症、心脏损伤和/或细胞因子风暴，甚至导致死亡。
[0003]研究表明，SARS
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CoV
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2感染时首先会通过刺突糖蛋白(S蛋白)与上皮细胞表面的血管紧张素转换酶
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2(ACE
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2)结合，随后宿主跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)促进病毒进入细胞。病毒进入细胞后进行主动复制和释放，使宿主细胞发生凋亡并释放损伤相关的分子模式(DAMP)，包括ATP、核酸和ASC寡聚物等。大多数患者在感染这一步相对相似，但COVID
‑
19的严重程度很大程度上取决于宿主免疫反应的异质性。在健康的免疫反应中，可以通过先天性免疫反应和随后的适应性免疫反应，在病毒扩散之前消灭被感染的细胞。但在有缺陷的免疫反应中，病毒在肺泡上皮细胞的反复复制导致了细胞的程序性细胞死亡和IL1β的分泌。邻近的上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞使用各种模式识别受体 (PRR)来检测释放的病原体相关分子模式(PAMP)和DAMP，启动先天性免疫反应，分泌大量促炎细胞因子和趋化因子，如白介素(IL2、IL6、IL8、IL17、IFNγ)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和干扰素诱导蛋白10(IP
‑
10)等。这些细胞因子又吸引单核细胞、巨噬细胞和T细胞到达感染部位，造成肺部免疫细胞的进一步积累，导致肺部淋巴细胞浸润气道以及淋巴细胞减少症。这些免疫细胞通过适应性免疫反应建立了一个促炎症反应的反馈回路，随后产生其他炎症细胞因子，包括IL7、IL10、粒细胞集落刺激因子(G
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CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)、巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP1α)、肿瘤坏死因子
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α(TNFα)等，在人体内引起细胞因子风暴(CRS)，最终损害肺组织，并且由此产生的细胞因子风暴会循环到其他器官，导致多器官损伤。
[0004]细胞因子风暴是在SARS
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CoV
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感染患者中观察到的关键病理特征之一，在严重的人类冠状病毒(CoV)(如SARS和MERS)感染中很常见。COVD
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19危重患者中存在高水平的细胞因子。其中TNFα、IL6和IL1β主要由先天免疫细胞释放，可能是SARS
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CoV
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2 感染晚期患者中细胞因子释放综合征和严重全身炎症反应的主要驱动因素之一。而 CCL2/3/5、CXCL8/9/10、IFN
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γ、TNFα、IL1β、IL1RA、IL6、IL7、IL8、IL12、IL33、粒细胞/粒细胞
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巨噬细胞集落刺激因子(G
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CSF和GM
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CSF)、血管内皮生长因子A (VEGFA)和血小板衍生生长因子亚基B(PDGFB)等趋化因子和细胞因子的升高，进一步导致严重的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和组织损伤。细胞因子风暴主要由巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、NK细胞、B细胞和T细胞
为主的多种免疫细胞的过度激活产生。虽然树突状细胞和巨噬细胞通过抗原递呈激活的SARS
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CoV
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2特异性T细胞可以在早期介导抗病毒应答，但SARS
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CoV
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2的免疫逃逸能力可能使T细胞难以产生有效的抗病毒应答，重要的是，T细胞介导的炎症和固有免疫细胞的持续激活可能是导致肺部病理和严重病例中出现的继发性并发症的因素。同时研究发现T细胞或B细胞激活很少的患者病情较轻，而CD4
+
T细胞和CD8
+
T细胞过度激活的患者病情更严重，也表明T细胞在介导COVID
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19患者炎症反应的作用。这些证据表明COVID
‑
19可能是一个免疫相关疾病，成为首个有强有力证据支持使用免疫疗法的严重急性传染病，因此通过免疫调控的治疗方法将对减轻炎症反应、改善患者的生存、降低死亡率有重要作用。
[0005]面对新冠病毒的全球大流行形势，科学家们一直在寻求开发预防、治疗SARS
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CoV
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2 感染的疫苗和有效药物，但目前还没有具体有效的治疗方法。除了疫苗研发外，主要的治疗药物包括抗病毒药物及免疫调节药物。抗病毒药物针对的是病毒感染进入细胞过程中的介导物，包括受体结合域(RBD)/血管紧张素转换酶2(ACE2)、跨膜蛋白酶丝氨酸2 (TMPRSS2)、3C样蛋白酶(M
pro
)、RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)等，通常在疾病早期使用。免疫调节药物通过调节免疫反应，缓解炎症反应、细胞因子风暴及继发的组织损伤和急性呼吸窘迫综合征等症状。旨在减轻疾病严重程度的治疗方法的研发也是全球最重要的优先事项。目前使用的免疫调节药物主要包括三类。第一类是以地塞米松为主的皮质类固醇，多项研究表明地塞米松能够降低患者死亡率，特别是对治疗期间病情加重的患者具有显著有益效果。但值得注意的是，皮质类固醇类药物由于广泛的、非特异的免疫抑制作用，可能在治疗早期对患者产生有害作用。第二类是激酶抑制剂，比如JAK抑制剂巴瑞替尼(baricitinib)。研究表明baracitinib治疗组患者相较于安慰剂组恢复时间更短，并且baracitinib治疗能够降低患者死亡率，在需要高流量氧气或无创通气的亚组中效果更为明显。FDA最近批准baracitinib用于紧急治疗COVID
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19。另外，一种胞质多酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)也在荷兰一项针对400名COVID
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19住院患者的临床试验中发现具有较好的效果，但是这些发现需要后续试验来验证，并判断哪些患者可能受益于伊马替尼治疗。在研的其他激酶抑制剂包括Bruton
’
s酪氨酸激酶抑制剂(如ibrutinib、 acalabrutinib、zanubrutinib)、磷脂酰肌醇
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3激酶(PI3K)/雷帕霉素(mTOR)抑制剂(如 duvelisib、tems本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组T细胞在体外构建细胞因子风暴模型中的应用，其特征在于：该重组T细胞的细胞膜表面修饰有如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.04所示的SARS
‑
CoV
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2S特异性嵌合抗原受体。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：(1)制备表达新冠病毒表面S蛋白的293T细胞；(2)将步骤(1)所得的293T细胞以1.8
‑
2.2
×
104接种后，于36
‑
38℃、4.5
‑
5.5％CO2培养箱中培养10
‑
12h，再加入所述重组T细胞和单核细胞系THP
‑
1细胞于36
‑
38℃、4.5
‑
5.5％CO2培养箱中共培养70
‑
75h，其中，重组T细胞与培养后的293T细胞的效靶比为5
‑
30∶1，单核细胞系THP
‑
1细胞与培养后的293T细胞的比例为2
‑
50∶1。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述重组T细胞与所述培养后的293T细胞的效靶比为5
‑
10∶1，所述单核细胞系THP
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1细胞与所述培养后的293T细胞的比例为5
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10∶1。4.一种细胞因子风暴模型的体外构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)制备表达新冠病毒表面S蛋白的293T细胞；(2)将步骤(1)所得的293T细胞以1.8
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2.2
×
104接种后，于36
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38℃、4.5
‑
5.5％CO2培养箱中培养10
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12h，再加入所述重组T细胞和单核细胞系THP
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1细胞于36
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38℃、4.5
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5.5％CO2培养箱中共培养70
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75h；该重组T细胞的细胞膜表面修饰有如SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.04所示的SARS
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CoV
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2S特异性嵌合抗原受体。5.如权利要求4所述的体外构建方法，其特征在于：所述重组T细胞与所述培养后的293T细胞效靶比为5
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30∶1，所述单核细胞系THP
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘文，夏琳，刘珺懿，胡雅泓，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：