用于蛋白质聚乙二醇化的添加剂体系制造技术

本公开提供了用于蛋白质聚乙二醇化的添加剂体系。所述添加剂体系包含单独使用或与芳族胺如3,5

【技术实现步骤摘要】
用于蛋白质聚乙二醇化的添加剂体系
[0001]本申请是申请日为2016年11月22日，申请号为201680067897.7，名称为“用于蛋白质聚乙二醇化的添加剂体系”的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用本专利申请要求2015年11月23日提交的临时专利申请62/258644的权益，其教导通过引用明确地并入本文。


[0003]本公开涉及用于蛋白质聚乙二醇化反应的改进的添加剂体系。具体而言，本公开鉴定了用于含有对乙酰基苯丙氨酸残基的蛋白质和氨氧基
‑
PEG化合物之间的缀合反应的添加剂。
[0004]背景蛋白质的聚乙二醇化是一种缀合过程，其涉及聚乙二醇衍生物与治疗性蛋白质的连接以通过降低清除率并提供空间庇护使免遭蛋白水解酶和免疫系统识别来提高其稳定性和药代动力学(Robens，M.J.等人，Adv.Drug Delivery Rev，54：459(2002))。通常，聚乙二醇化技术可以分为两种类型，即随机和位点特异性缀合。随机聚乙二醇化任意地将聚乙二醇化试剂与反应性氨基酸如赖氨酸或半胱氨酸连接以提供聚乙二醇化产物的混合物。相反，位点特异性缀合利用天然官能团(例如N
‑
或C
‑
端基团)或非大然氨基酸(例如对乙酰基苯丙氨酸
‑
pAcF)的明确反应性来控制连接在蛋白质上的PEG残基的位置和数目。涉及聚乙二醇化试剂与pAcF残基之间的酮肟形成的位点特异性缀合反应通过遗传密码的扩充被掺入底物蛋白质中(Liu，C.C.等人，Annu.Rev.Biochem.，79：413(2010)；Tian，F等人，
″
Accelerants for the modification of non
‑
natural amino acids and non
‑
natural amino acid polypeptides"，美围专利号7,468,458(2008年12月23日))。尽管它们具有已证实的效用，但基于酮肟形成的缀合因速率慢和转化不完全而受到损害(Crisalli，P.等人，J.Org.Chem.，78：1184(2013))。改善酮肟形成的尝试包括使用过量的聚乙二醇化试剂，高温或高浓度的毒性催化剂。然而，这些解决方案引入了额外的步骤以从产物中除掉过量的聚乙二醇化试剂或毒性催化剂并且经常损害蛋白质的稳定性。此外，旧方法不使用添加剂，使用变性剂(脲)，和/或使用乙酰肼(AcNHNH2)作为添加剂。AcNHNH2和相关结构已经在PCT公开号WO 2007/056448中进行了限定。
[0005]本领域现在需要通过检查影响失速的机械原理和通过鉴定加速反应并促进在低PEG：蛋白质摩尔比下的高转化率的新添加剂来提高含有pAcF残基的蛋白质(松弛素和FGF21)的聚乙二醇化的产率和速率的新方法。该方法应该是经济的，促进在非常低量的聚乙二醇化试剂下的较高转化率，促进更快的反应，其避免了需要高反应温度和除掉遗传毒性物质。
[0006]概述在第一个实施方案中，本公开提供用于蛋白质聚乙二醇化反应的改进的添加剂体系，所述体系包含单独的对氨基苯甲酰肼或与芳族胺或铵盐组合的对氨基苯甲酰肼。
[0007]在另一个实施方案中，本公开提供了用于获得聚乙二醇化蛋白质的方法，所述方
法包括以下步骤：鉴定蛋白质、PEG试剂和添加剂体系；和溶解蛋白质，然后在添加剂体系存在下将所述蛋白质与PEG试剂混合，从而以高产率获得聚乙二醇化蛋白质。
[0008]在另一个实施方案中，本公开提供了包含通过上述实施方案中提及的方法获得的聚乙二醇化蛋白质的药物组合物，其用于需要其的个体的治疗。
[0009]附图简述图1：形成酮肟的一般机制。
[0010]图2：松弛素(4mg/mL，在水中)与20kDa PEG
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OA试剂的聚乙二醇化的色谱图。
[0011]图3：当暴露于连续的空气流时，20kDa PEG
‑
OA在水中分解的时间进程。
[0012]图4：使用原位IR和1H NMR光谱研究乙酰肼的稳定性。
[0013]图5：筛选添加剂的模型反应。反应条件：1(36mmol)和2(36mmol)，在1.0mL乙酸盐缓冲液(20mM，pH 4.0)中，在室温(23℃)下。
[0014]图6：对不同添加剂观察到的相对速率(k
rel
)。乙酰肼(k
rel
≈2)显示在方框中。
[0015]图7：在(a)1当量吡唑胺(红色)；(b)1当量MCH(蓝色)；(c)1当量吡唑胺和1当量MCH(绿色)存在下，二肽1与O
‑
苄基羟胺(2)的反应的时间进程。在没有添加剂的情况下获得的反应曲线以灰色显示。
[0016]图8：含有二肽1(a)(蓝色)与(b)1当量MCH(绿色)；(c)1当量MCH和1当量吡唑胺(灰色)；(d)1当量吡唑胺(红色)的样品的1H NMR光谱的芳族区域。MCH和吡唑胺添加剂之间的协同效应产生具有更高浓度活性中间体的混合物，与仅含有一种添加剂的样品相比。
[0017]图9：左：二肽1与30当量PABH和12当量20kDa PEG
‑
OA的聚乙二醇化；腙中间体被追踪为绿点。右：聚乙二醇化反应，其中在使二肽与30当量PABH平衡过夜后添加1.2当量聚乙二醇化试剂。
[0018]图10：左：用于二肽1聚乙二醇化的腙浓度对PABH当量的图；蓝点表示其中省略了吡唑胺的反应混合物。中：PABH和吡唑胺的不同组合对反应速率的影响。右：二肽1及其腙衍生物在含有PABH和吡唑胺的反应混合物中的最终浓度。
[0019]图11：反应结束时剩余二肽1对总添加剂当量和吡唑胺：PABH比例的图。
[0020]图12：左：在(a)30当量乙酰肼(蓝色)；(b)30当量MCH(红色)存在下，松弛素与20kDa PEG
‑
OA(15当量)的反应的时间进程；在没有添加剂的情况下获得的反应曲线以灰色显示。中：在(a)30当量吡唑胺(蓝色)；(b)30当量MCH(红色)；(c)10当量MCH(紫色)；(d)30当量吡唑胺和10当量MCH(绿色)；(e)30当量MCH和30当量吡唑胺存在下松弛素与PEG
‑
OA(15当量)的反应的时间进程。右：在(a)40℃；(b)10℃；(c)25℃下，在30当量吡唑胺和10当量MCH存在下，松弛素与PEG
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OA(15当量)的反应的时间进程。
[0021]图13：左：在(a)30当量MPCH和30当量吡唑胺(绿色)；(b)30当量PH和30当量吡唑胺(蓝色)；和(c)30当量MCH和30当量吡唑胺/脲6M(红色)存在下，松弛素与20kDa PEG
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OA(1.2当量)的反应的时间进程。右：在(a)30当量PH和60当量吡唑胺(蓝色)；(b)30当量乙酰肼和60当量本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于蛋白质聚乙二醇化反应的改进添加剂体系，所述体系包含单独的对氨基苯甲酰肼或对氨基苯甲酰肼与芳族胺或铵盐的组合。2.如权利要求1所述的体系，其中所述芳族胺选自3,5
‑
二氨基苯甲酸、邻苯二胺、1
‑
吡啶
‑2‑
基
‑
乙胺、2
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(二甲基氨基)乙肼、间苯二胺和2
‑
氨甲基吡啶。3.如权利要求1所述的体系，其中所述铵盐选自乙酸铵和氯化铵。4.如权利要求1所述的体系，其中优选体系组合包含对氨基苯甲酰肼与3,5
‑
二氨基苯甲酸或对氨基苯甲酰肼与氯化铵。5.如权利要求1所述的体系，其中所述反应是含有对乙酰基苯丙氨酸残基的蛋白质和氨氧基
‑
PEG化合物之间的缀合反应。6.如权利要求1所述的体系，其中所述添加剂体系增加缀合反应速率，提供高缀合产物产率并促进完成缀合反应所需的氨氧基
‑
PEG当量的减少。7.用于获得聚乙二醇化蛋白质的方法，所述方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：MR希基，A拉米雷斯，
申请(专利权)人：百时美施贵宝公司，
类型：发明
国别省市：