熔解曲线法在人乳头瘤病毒的分型和定性分析中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种熔解曲线法在人乳头瘤病毒的分型和定性分析中的应用，本发明专利技术通过对18种高危和中危型HPV的E6/E7DNA及内参β

【技术实现步骤摘要】
熔解曲线法在人乳头瘤病毒的分型和定性分析中的应用


[0001]本专利技术属于核酸检测
，特别涉及一种熔解曲线法在人乳头瘤病毒的分型和定性分析中的应用。

技术介绍

[0002]人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)根据致癌性分为高危型和低危型。子宫颈癌主要由高危型HPV持续感染所致，在99.7％的子宫颈癌中都可检测到高危型HPV。此外，高危型HPV还可导致肛门、阴道、外阴、阴茎、头颈等部位的癌症。低危型HPV可引起肛门生殖器疣和复发性呼吸道乳头瘤等疾病。2017年，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)立场文件显示，HPV感染与全球约4.5％的癌症新发病例相关。国际癌症研究署(International Agency for Research on Cancer，IARC)公布的结果显示，2018年全球估计有近57万女性新患子宫颈癌，31余万女性死于子宫颈癌；其中，我国子宫颈癌新发病例近11万人，死亡病例近5万人。子宫颈癌已成为严重威胁女性健康的公共卫生问题。
[0003]目前，约有200种HPV型别从人体中鉴定出来，HPV型别的区分主要基于一个位于L1 ORF基因上291bp的片段，不同HPV型别间L1基因的差异超过10％。根据主要感染部位，分为皮肤型和黏膜型；根据致癌潜力，分为高危型和低危型。2012年，IARC将HPV分为三组：第一组致癌物(人类致癌物)，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59，第二组A类致癌物(很可能导致人类癌症的物质)，包括HPV68，第二组B类致癌物(可能导致人类癌症的物质)，包括HPV26、53、66、73和82等，第三组对人类致癌性尚不能确定，包括HPV6和11等。
[0004]HPV的核酸检测是继细胞学检查之后、广泛用于临床的另一种子宫颈癌筛查技术，并以其高度的敏感性和阴性预测值弥补了细胞学的不足，快速、便捷，可高通量、自动化进行。HPV的分型检测对于临床追踪HPV的持续感染状态、CIN及子宫颈癌的治疗后追踪评价均有意义。
[0005]本专利技术提出了一种基于熔解曲线技术的快速分型和定性检测18种高、中危HPV型别的方法，可在三个反应管内同时分型检测18种HPV型别，灵敏度高，特异性好，具有明确的临床意义及潜在的应用价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种熔解曲线法在人乳头瘤病毒的分型和定性分析中的应用。
[0007]利用PCR扩增结合熔解曲线分析的技术原理，设计HPV E6/E7区特异性引物探针，对人乳头瘤病毒感染的患者做出精准的临床辅助诊断，从而丰富HPV临床检测的技术手段。
[0008]本专利技术的技术方案如下：
[0009]一种用于同时检测多种人乳头瘤病毒的引物探针组合，包括以下引物探针组中的任意两种及以上；
[0010]用于检测HPV16的引物探针组：其中，用于检测HPV16的引物序列如SEQ ID No.1和
SEQ ID No.2所示；用于检测HPV16的探针序列如SEQ ID No.3；
[0011]用于检测HPV35的引物探针组：其中，用于检测HPV35的引物序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；用于检测HPV35的探针序列如SEQ ID No.6；
[0012]用于检测HPV18的引物探针组：其中，用于检测HPV18的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；用于检测HPV18的探针序列如SEQ ID No.9；
[0013]用于检测HPV45的引物探针组：其中，用于检测HPV45的引物序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；用于检测HPV45的探针序列如SEQ ID No.12；
[0014]用于检测HPV31的引物探针组，其中，用于检测HPV31的引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；用于检测HPV31的探针序列如SEQ ID No.15；
[0015]用于检测HPV52的引物探针组，其中，用于检测HPV52的引物序列如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示；用于检测HPV52的探针序列如SEQ ID No.18；
[0016]用于检测HPV33的引物探针组，其中，用于检测HPV33的引物序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示；用于检测HPV33的探针序列如SEQ ID No.21；
[0017]用于检测HPV58的引物探针组，其中，用于检测HPV58的引物序列如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示；用于检测HPV58的探针序列如SEQ ID No.24；
[0018]用于检测HPV56的引物探针组，其中，用于检测HPV56的引物序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示；用于检测HPV56的探针序列如SEQ ID No.27；
[0019]用于检测HPV66的引物探针组，其中，用于检测HPV66的引物序列如SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示；用于检测HPV66的探针序列如SEQ ID No.30；
[0020]用于检测HPV39的引物探针组，其中，用于检测HPV39的引物序列如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示；用于检测HPV39的探针序列如SEQ ID No.33；
[0021]用于检测HPV68的引物探针组，其中，用于检测HPV68的引物序列如SEQ ID No.34和SEQ ID No.35所示；用于检测HPV68的探针序列如SEQ ID No.36；
[0022]用于检测HPV51的引物探针组，其中，用于检测HPV51的引物序列如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示；用于检测HPV51的探针序列如SEQ ID No.39；
[0023]用于检测HPV82的引物探针组，其中，用于检测HPV82的引物序列如SEQ ID No.40和SEQ ID No.41所示；用于检测HPV82的探针序列如SEQ ID No.42；
[0024]用于检测HPV26的引物探针组，其中，用于检测HPV26的引物序列如SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示；用于检测HPV26的探针序列如SEQ ID No.45；
[0025]用于检测HPV53的引物探针组，其中，用于检测HPV53的引物序列如SEQ ID No.46和SEQ ID No.47所示；用于检测HPV53的探针序列如SEQ ID No.48；
[0026]用于检测HPV59的引物探针组，其中，用于检测HPV59的引物序列如SEQ ID No.49和SEQ ID No.50所示；用于检测HPV59的探针序列如SEQ ID No.51；
[0027]用于检测HPV73的引物探针组，其中，用于检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测多种人乳头瘤病毒的引物探针组合，其特征在于，包括以下引物探针组中的任意两种及以上；用于检测HPV16的引物探针组：其中，用于检测HPV16的引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；用于检测HPV16的探针序列如SEQ ID No.3；用于检测HPV35的引物探针组：其中，用于检测HPV35的引物序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；用于检测HPV35的探针序列如SEQ ID No.6；用于检测HPV18的引物探针组：其中，用于检测HPV18的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；用于检测HPV18的探针序列如SEQ ID No.9；用于检测HPV45的引物探针组：其中，用于检测HPV45的引物序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；用于检测HPV45的探针序列如SEQ ID No.12；用于检测HPV31的引物探针组，其中，用于检测HPV31的引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；用于检测HPV31的探针序列如SEQ ID No.15；用于检测HPV52的引物探针组，其中，用于检测HPV52的引物序列如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示；用于检测HPV52的探针序列如SEQ ID No.18；用于检测HPV33的引物探针组，其中，用于检测HPV33的引物序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示；用于检测HPV33的探针序列如SEQ ID No.21；用于检测HPV58的引物探针组，其中，用于检测HPV58的引物序列如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示；用于检测HPV58的探针序列如SEQ ID No.24；用于检测HPV56的引物探针组，其中，用于检测HPV56的引物序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示；用于检测HPV56的探针序列如SEQ ID No.27；用于检测HPV66的引物探针组，其中，用于检测HPV66的引物序列如SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示；用于检测HPV66的探针序列如SEQ ID No.30；用于检测HPV39的引物探针组，其中，用于检测HPV39的引物序列如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示；用于检测HPV39的探针序列如SEQ ID No.33；用于检测HPV68的引物探针组，其中，用于检测HPV68的引物序列如SEQ ID No.34和SEQ ID No.35所示；用于检测HPV68的探针序列如SEQ ID No.36；用于检测HPV51的引物探针组，其中，用于检测HPV51的引物序列如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示；用于检测HPV51的探针序列如SEQ ID No.39；用于检测HPV82的引物探针组，其中，用于检测HPV82的引物序列如SEQ ID No.40和SEQ ID No.41所示；用于检测HPV82的探针序列如SEQ ID No.42；用于检测HPV26的引物探针组，其中，用于检测HPV26的引物序列如SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示；用于检测HPV26的探针序列如SEQ ID No.45；用于检测HPV53的引物探针组，其中，用于检测HPV53的引物序列如SEQ ID No.46和SEQ ID No.47所示；用于检测HPV53的探针序列如SEQ ID No.48；用于检测HPV59的引物探针组，其中，用于检测HPV59的引物序列如SEQ ID No.49和SEQ ID No.50所示；用于检测HPV59的探针序列如SEQ ID No.51；用于检测HPV73的引物探针组，其中，用于检测HPV73的引物序列如SEQ ID No.52和SEQ ID No.53所示；用于检测HPV73的探针序列如SEQ ID No.54。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括用于检测人
β
‑
globin内参基因的引物探针组合；用于检测人β
‑
globin内参基因的引物序列如SEQ ID No.55和SEQ ID No.56用于检测人β
‑
globin内参基因的探针序列如SEQ ID No.57。3.一种包括如权利要求1或2所述的引物探针组的试剂盒。4.熔解曲线法在不同人乳头瘤病毒的分型和定性分析中的应用，其特征在于，所述应用为HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82的分型和定性分析，所述分型和定型分析包括以下步骤：S1.根据HPV型别E6/E7 DNA设计特异性引物探针；S2.根据人β
‑
globin基因设计一对内参基因引物探针；S3.将HPV16、HPV35、HPV18、HPV45、HPV31、HPV52和内参基因引物探针与PCR所需的物料组合成HPV
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A组反应液；将HPV33、HPV58、HPV56、HPV66、HPV39、HPV68和内参基因引物探针与PCR所需的物料组合成HPV
‑
B组反应液；将HPV51、HPV82、HPV53、HPV26、HPV59、HPV73和内参基因引物探针与PCR所需的物料组合成HPV
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C组反应液；S4.在反应液中加入样本核酸后利用不对称PCR扩增技术结合熔解曲线分析在荧光PCR仪上进行扩增；S5.根据不同通道的荧光扩增信号来判读样本是否为阳性，并对阳性的核酸在对应的荧光通道采用熔解曲线分析结果进行分型。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：HPV
‑
A组反应液中：FAM通道熔解曲线分析对应的HPV型别依次为HPV16和HPV35；CY5通道熔解曲线分析对应的HPV型别依次为HPV18和HPV45；ROX通道熔解曲线分析对应的HPV型别依次为HPV31和HPV52；VIC通道熔解曲线分析对应内参基因β
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globin；HPV
‑
B组反应液中：FAM通道熔解曲线分析对应的HPV型别依次为HPV33和HPV58；CY5通道熔解曲线分析对应的HPV型别依次为HPV56和HPV66；ROX通道熔解曲线分析对应的HPV型别依次为HPV39和HPV68；VIC通道熔解曲线分析对应内参基因β
‑
globin；HPV
‑
C组反应液中：FAM通道熔解曲线分析对应的HPV型别依次为HPV51和HPV82；CY5通道熔解曲线分析对应的HPV型别依次为HPV26和HPV53；ROX通道熔解曲线分析对应的HPV型别依次为HPV59和HPV73；VIC通道熔解曲线分析对应内参基因β
‑
globin。6.根据权利要求5所述的的应用，其特征在于：HPV
‑
A组反应液中引物探针序列如下：用于检测HPV16的引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；用于检测HPV16的探针序列如SEQ ID No.3；用于检测HPV35的引物序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；用于检测HPV35的探针序列如SEQ ID No.6；
用于检测HPV18的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；用于检测HPV18的探针序列如SEQ ID No.9；用于检测HPV45的引物序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；用于检测HPV45的探针序列如SEQ ID No.12；用于检测HPV31的引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；用于检测HPV31的探针序列如SEQ ID No.15；用于检测HPV52的引物序列如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小康，张蓉，郭玉婉，陈永红，吴惟茜，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：