可与葡萄糖氧化酶高效偶联的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术和绿色化工领域，具体公开了一种可与葡萄糖氧化酶高效偶联的耻垢分枝杆菌酰基转移酶（MsAcT）突变体及其制备方法和应用。所述MsAcT突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术制备的MsAcT突变体对氧化氢的亲和力较野生型MsAcT提高了50倍，可高效催化芳樟醇的环氧化，产业化前景良好。产业化前景良好。

【技术实现步骤摘要】
可与葡萄糖氧化酶高效偶联的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和绿色化工领域，尤其是涉及一种可与葡萄糖氧化酶高效偶联的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]过氧乙酸（Peracetic acid，PAA），化学式为CH3COOOH。作为一种重要的化工原料，过氧乙酸可作为漂白剂应用于纺织品及造纸制浆的漂白工艺中；可作为氧化剂应用于有机合成中；可作为灭菌剂应用于对被病菌病毒污染的医疗器械及医疗废水的灭菌处理。过氧乙酸作为灭菌剂具有广谱高效的特点，对包括细菌、真菌、芽孢和病毒等在内的微生物均具有较强的灭菌作用，因此，还被广泛应用于对畜牧养殖业饲养场地的消毒。全世界每年市场销售额逾6亿美元。
[0003]过氧乙酸当前的主流生产工艺为化学合成法：即以浓硫酸作为强氧化剂，以过氧化氢和乙酸（或乙酸酯等）作为原料，合成过氧乙酸。该生产工艺中，浓硫酸和过氧化氢为强氧化剂，有强烈的腐蚀性，因此对生产设备具有较高的要求；同时，该生产工艺存在严重的安全隐患（浓硫酸属于危险品类化学试剂；特别是过氧乙酸在浓度大于70%（v/v）时容易爆炸）。稀释后的低浓度过氧乙酸又极不稳定，货架半衰期短。在未加稳定剂的情况下，低浓度的过氧乙酸两个月内浓度将下降超过20%；常用的稳定剂，又多为有毒化合物（如致癌物8
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羟基喹啉等）。为克服过氧乙酸贮存和运输过程中的困难，市场零售的过氧乙酸产品，常采用原位合成法。即销售商提供两种溶液（溶液Ⅰ和溶液Ⅱ），分别含有一定浓度的硫酸/过氧化氢和乙酸酯，由客户按照需要自行以一定比例混合，从而制备出低浓度的过氧乙酸。这种合成工艺，难以实现标准化生产，产品质量也难以控制，导致其应用效果受到很大的消极影响。
[0004]酶法制备过氧乙酸是利用某些生物催化剂的过水解活性，即在常温常压下，催化乙酸乙酯（或乙酸等）与过氧化氢反应，合成过氧乙酸的催化活性（反应式如下）。在酶蛋白作用下，推动反应向右进行合成过氧乙酸的催化活性，即为过水解活性。
[0005]过氧乙酸是一种强氧化剂，其对酶蛋白稳定性产生消极影响，因此过氧乙酸的酶法合成反应常常与过氧乙酸的原位化学氧化反应（In Situ Chemical Oxidation，ISCO）相串联：即将待氧化处理的还原剂（或合成反应中的还原性底物）同时加入到酶法制备过氧乙酸的反应体系中，过氧乙酸一旦生成就立即与反应体系中的还原性物质（如合成反应中含烯键或炔键的原料；印染废水中的染料；医疗废水中的病原微生物等）发生反应而被消耗。酶法合成过氧乙酸—过氧乙酸原位化学氧化串联的生产工艺，反应条件温和，反应过程易
于控制，不仅能实现标准化生产，而且过氧乙酸的产率和产量均可精准调控；合成的过氧乙酸在原位即可进行氧化反应而被消耗掉，因而不会出现爆炸等情形。作为一种绿色生产工艺，该工艺已成功应用于纤维素的预处理、木质素的降解、纸浆漂白、油脂深加工（环氧化）、印染物的漂白脱色、洁牙、污水处理、消毒等诸多领域，并表现出良好的应用效果。
[0006]在已发现的各种具有过水解催化活性的酶蛋白中，仅耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)产生的酰基转移酶(Acyl transferase)（本申请材料中缩写为MsAcT）的P/H值大于1（即催化过水解反应的速率（P）大于催化水解反应的速率(H)）。MsAcT是到目前为止，已发现的过水解活性最高的酶蛋白，其催化过水解反应的反应速率是脂解酶的50倍。MsAcT催化过氧乙酸合成
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过氧乙酸原位化学氧化串联反应工艺，可以解决产物过氧乙酸（强氧化剂）对酶蛋白稳定性产生的消极影响。但反应体系中，依然存在另外一种强氧化剂：底物过氧化氢。过水解活性是MsAcT蛋白的多功能活性（Promiscuous activity），MsAcT对过氧化氢的亲和力较小，因此反应体系中必须存在高浓度的过氧化氢，才能推动串联反应向合成过氧乙酸的方向高效进行（实际使用过程中，过氧化氢的浓度常常大于10 mmol/L）。如何有效解决反应体系中高浓度过氧化氢对酶蛋白稳定性产生的消极作用，科技工作者尝试了多种方法：(1)利用蛋白质工程技术提高酶蛋白对过氧化氢的耐受性。但考虑到
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过氧化氢对蛋白质多肽链中的多种氨基酸残基(如甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸等)、二硫键等均有破坏作用；影响蛋白质的二级结构或高级结构的构象；
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对某些合成反应而言，反应体系中存在的高浓度过氧化氢，将严重影响体系中其他化合物（底物、中间产物或终产物）的稳定性。因此，本策略的应用效果和范围还存在一定的局限性。（2）建立过氧化氢的合成反应与消耗反应串联的反应工艺。众所周知的辣根过氧化物酶酶活分析方法和胆固醇氧化酶酶活分析方法，均应用到了此串联反应（即利用葡萄糖氧化酶催化产生的过氧化氢，分别作为辣根过氧化物酶或胆固醇氧化酶的底物）。双（多）酶催化的串联反应工艺，可最大限度地降低不稳定或具有毒副作用的中间产物对酶蛋白产生的消极作用。
[0007]利用葡萄糖氧化酶(GOD)与耻垢分枝杆菌酰基转移酶(MsAcT)偶联，催化葡萄糖和乙酰乙酸酯转化为过氧乙酸。过氧乙酸可原位氧化某些化合物的脱色、杀菌、某些烯烃的环氧化等。该偶联工艺，可应用于美白等日化产品、有机合成、医疗用品的消毒、污水处理等领域。具体技术路线如下：。
[0008]然而，在上述工艺路线中，由于耻垢分枝杆菌酰基转移酶对过氧化氢的亲和力较低，因此为维持该催化工艺的高效运行，反应体系中需要加入大量的葡萄糖氧化酶，葡萄糖
氧化酶与耻垢分枝杆菌酰基转移酶的酶活比例需要达到50:1。而过量使用葡萄糖氧化酶，一方面增加了该工艺的运行成本；另外一方面，反应体系中将积累过量的过氧化氢，同样会致酶蛋白变性失活，影响该反应体系的操作稳定性。
[0009]因此，为了更好地优化上述偶联催化体系，需要利用蛋白质工程技术，改良MsAcT蛋白，提高其对过氧化氢的亲和力，降低偶联体系中葡萄糖氧化酶与耻垢分枝杆菌酰基转移酶的酶活比例。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可与葡萄糖氧化酶高效偶联的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体及其制备方法和应用。
[0011]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术首先提供了一种对过氧化氢具有高亲和性的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT
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Gln，所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT
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Gln的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]本专利技术进一步提供了一种编码上述的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT
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Gln的基因，所述基因的核苷酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对过氧化氢具有高亲和性的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT
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Gln，其特征在于：所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT
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Gln的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT
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Gln的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.包含权利要求2所述基因的重组载体。4.包含权利要求3所述重组载体的重组菌株。5.获得权利要求1所述耻垢分枝杆菌酰基转移酶突变体MsAcT
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Gln的方法，其特征在于：通过定点突变获...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒正玉，李欢，贾文敬，张晨露，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：