NtERF4基因及其在总黄酮与绿原酸合成调控中应用制造技术

本申请属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个烟草NtERF4基因及其在总黄酮与绿原酸合成调控中应用。发明专利技术人克隆获得了一个可以促进烟草总黄酮与绿原酸合成的转录因子基因NtERF4。对其结构进行分析后，其属于ERF类转录因子（一类乙烯转录因子）中的AP2亚族。该基因表达量与烟叶中总黄酮及绿原酸含量呈现正相关关系，即，通过超表达该基因，可以提高烟叶中总黄酮及绿原酸含量，而通过基因沉默方式降低该基因表达量后，可以降低烟叶中总黄酮及绿原酸含量。同时，相关基因表达模式研究结果表明，NtERF4转录因子对烟草叶片总黄酮与绿原酸合成调节，是通过NtPAL、NtGST和NtGT基因调节通路来实现的。路来实现的。

【技术实现步骤摘要】
NtERF4基因及其在总黄酮与绿原酸合成调控中应用


[0001]本申请属于烟草基因工程
，具体涉及一个烟草NtERF4基因及其在总黄酮与绿原酸合成调控中应用。

技术介绍

[0002]烟草是我国重要的经济作物之一。烟草中多酚类物质主要有单宁类（绿原酸）、香豆素类（莨菪灵、莨菪亭、 七叶亭）和黄酮类（芸香苷、黄酮、鼠李糖），而这些多酚类物质与烟草的香气质、香气量、刺激性及透发性等高度相关。因此，对于烟草中多酚类物质代谢调控机制的深入研究，不仅对于改善烟草质量具有重要意义，对于其他植物改良也具有较好的基础技术研究意义。
[0003]一般而言，植物体内的黄酮与绿原酸含量既受外界环境影响因素影响（例如受包括光照强度、紫外线、温度、氮素水平等非生物因素或病菌感染等生物因素），也受植物激素的内在调节。但总体上，无论是外在的环境因素还是内在的发育调控因素，对黄酮及绿原酸合成的影响最终还是通过调控多酚类合成相关转录因子基因或功能基因的表达来实现的。
[0004]研究表明，总黄酮的主要合成途径涉及苯丙烷生物合成途径，其中参与调控总黄酮的功能基因主要有：苯丙氨酸氨解酶（PAL）、肉桂酸
‑4‑
羟化酶（C4H）、4
‑
香豆酰辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）等。而绿原酸的主要合成途径是羟基肉桂酰辅酶A奎尼羟基肉桂转移酶（HQT）催化咖啡酰辅酶A和奎尼酸合成绿原酸。其中，苯丙氨酸氨解酶是苯丙烷代谢途径的关键酶，影响反式肉桂酸的含量进而影响绿原酸的含量。而转录因子是调控基因表达的开关性元件，通过调节转录因子的表达水平可以有效地管控下游靶基因的活性，进而影响相应物质的合成和累积。目前已报道的参与调控总黄酮与绿原酸合成的转录因子有MYB、bHLH（basic helixloop
‑
helix）和WD40等。基于转录因子在基因表达调节中的重要作用，挖掘对于烟草中总黄酮与绿原酸合成具有重要调控的转录因子显然具有十分重要的技术意义。

技术实现思路

[0005]本申请目的在于提供一个烟草NtERF4基因，其作为一个ERF类转录因子家族中的AP2类转录因子，对于烟草的烟叶中的总黄酮与绿原酸的合成具有重要的调控作用。
[0006]本申请所采取的技术方案详述如下。
[0007]烟草NtERF4基因，其基因全长684 bp，基因无内含子，碱基序列如 SEQ ID No.1所示，具体如下：ATGGCTGTCAAAAATAAGGTTAGTAATGGTGATCTGAAAGGAGGAAATGTGAAAACAAATGGAGTTAAGGAGGTTCACTACAGAGGTGTAAGGAAGAGGCCATGGGGTCGGTATGCAGCTGAAATCCGTGACCCGGGTAAGAAGAGTCGGGTCTGGTTGGGTACTTTTGACACGGCGGAAGAGGCGGCTAAGGCGTACGACACTGCCGCTCGAGAGTTTCGTGGACCCAAAGCTAAAACTAACTTCCCTTTACCGTCGGAGAATCAGAGTACCAGTCACAGCAGCACCATGGAGTCCTCTAGCGGAGAGACTGGCATTCACGCGCCGCCTCATGCGCCGCTCGAGCTGGATCTCACGCGCCGACTTGGCTCC
GTAGCTGCTGATGGCGGTGACCACTGTCGTCGTTCTGGTGAAGTTGGGTACCCGATTTTCCACCAACAGCCGACGGTGGCGGTTCTCCCTAACGGCCAGCCGGTTTTGCTCTTTGATTCTTTGTGGCGGCCGGGAGTTGTTAACAGGCCTCAGCCTTACCATGTAATGCCGATGGCGATGGGGTTTAACGGCGTTAACGCCGGAGTGGATCCTACTGTGTCAGACTCGTCCTCTGTAGTGGAAGAGAACCAATATGATGGGAAAAGAGGAATTGATCTTGATCTTAACCTTGCTCCACCTACGGAATTTTGA。
[0008]烟草NtERF4基因所编码转录因子NtERF4蛋白，含有227个氨基酸，具体氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示；具体如下：MAVKNKVSNGDLKGGNVKTNGVKEVHYRGVRKRPWGRYAAEIRDPGKKSRVWLGTFDTAEEAAKAYDTAAREFRGPKAKTNFPLPSENQSTSHSSTMESSSGETGIHAPPHAPLELDLTRRLGSVAADGGDHCRRSGEVGYPIFHQQPTVAVLPNGQPVLLFDSLWRPGVVNRPQPYHVMPMAMGFNGVNAGVDPTVSDSSSVVEENQYDGKRGIDLDLNLAPPTEF*。
[0009]PCR扩增制备所述烟草NtERF4基因时，PCR扩增用引物序列设计如下：NtERF4
‑
F: 5
’‑
ATGGCTGTCAAAAATAAGGTTA
‑3’
，NtERF4
‑
R: 5
’‑
TCAAAATTCCGTAGGTGGAG
‑3’
。
[0010]含有所述烟草NtERF4基因的重组超表达载体，其以pCAMBIA1301质粒为载体，重组有烟草NtERF4基因。
[0011]针对所述烟草NtERF4基因的瞬时沉默VIGS载体，其构建过程中，以所述烟草NtERF4基因对第18位
‑
488位核苷酸序列作为引导序列。
[0012]所述烟草NtERF4基因或烟草NtERF4基因所编码转录因子NtERF4蛋白在烟草中应用，该基因或其所编码蛋白与烟叶中总黄酮和/或绿原酸含量相关；具体而言，烟草NtERF4基因（即，NtERF4蛋白含量）与烟叶中总黄酮及绿原酸含量呈现正相关关系；通过超表达NtERF4基以提高NtERF4蛋白含量后，用于提高烟叶中总黄酮及绿原酸含量；通过基因沉默技术（或者基因编辑技术）方式降低NtERF4基因以降低NtERF4蛋白含量后，用于降低烟叶中总黄酮及绿原酸含量。
[0013]所述烟草NtERF4基因在烟叶新品种培育中的应用，利用基因工程技术手段，通过制备获得含有烟草NtERF4基因的重组超表达载体、或者用于沉默烟草NtERF4基因的沉默载体，转化烟草后，可以筛选获得烟叶中总黄酮及绿原酸含量升高或者降低的烟草新品种。
[0014]本申请中，专利技术人基于普通烟草（Nicotiana tabacum）克隆获得了一个可以促进烟草总黄酮与绿原酸合成的转录因子基因NtERF4。对其结构进行分析后，其属于ERF类转录因子（一类乙烯转录因子）中的AP2亚族。进一步通过对该基因超表达或者基因沉默后，结果表明，该基因表达量与烟叶中总黄酮及绿原酸含量呈现正相关关系，即，通过超表达该基因，可以提高烟叶中总黄酮及绿原酸含量，而通过基因沉默方式（或者基因编辑技本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.烟草NtERF4基因，其特征在于，该基因碱基序列如 SEQ ID No.1所示。2.权利要求1所述烟草NtERF4基因所编码转录因子NtERF4蛋白，其特征在于，具体氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。3.含有权利要求1所述烟草NtERF4基因的重组超表达载体，其特征在于，该重组超表达载体以pCAMBIA1301质粒为载体，重组有烟草NtERF4基因；所述烟草NtERF4基因，碱基序列如 SEQ ID No.1所示。4.针对权利要求1所述烟草NtERF4基因的瞬时沉默VIGS载体，其特征在于，该VIGS载体以烟草NtERF4基因的第18位
‑
488位核苷酸序列作为引导序列；所述烟草NtERF4基因，碱基序列如 SEQ ID No.1所示。5.权利要求1所述烟草NtERF4基因在烟草中应用，其特征在于，该基因与烟叶中总黄酮和/或绿原酸含量相关；具体而言，烟草NtERF4基因与烟叶中总黄酮和/或绿原酸含量呈现...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书八页序列表电子公布附图四页，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：