一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法。该方法包括无植原体健康剑麻苗的筛选、经南瓜饲养脱毒获得不携带植原体的新菠萝灰粉蚧、从待传植原体发病剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的叶片，经特异性巢式PCR方法检测确认携带有植原体后，置于健康剑麻苗叶片基部处，待其自主迁移至接种剑麻植株，隔离培养4～6个月，即可获得经新菠萝灰粉蚧介导传播获得携带植原体的剑麻植株，其传毒率高达88.89％。本发明专利技术方法首次建立了一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法，为研究剑麻紫色卷叶病相关植原体的致病机理，以及开展抗紫色卷叶病剑麻种质筛选、鉴定、评价等工作提供技术指导。此方法具有操作性强、效率高、结果可靠等特点。结果可靠等特点。

【技术实现步骤摘要】
culture of plant pathogenic phytoplasmas.Phytopathol.Mediterr.,51(3)：607
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617；Contaldo N(2016)Development and evaluation of different complex media for phytoplasma isolation and growth.J.Microbiol.Meth.,127:105
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110.]，多数实验室很难获得植原体的纯培养。因此，不能像其他真核生物一样采用传统的分离培养法获得纯培养后，对植原体进行室内离体操作。
[0005]植原体是一种主要依赖于昆虫媒介传播的植物病原菌。通常通过叶蝉、木虱、飞虱、蜡蝉、蝽等具刺吸式口器的昆虫传播[Chen WY(2011)Detection and identification of a new phytoplasma associated with periwinkle leaf yellowing disease in Taiwan.Australas.Plant Pathol.,40:476
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483.Kosovac A(2019)Role of plant
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specialized Hyalesthes obsoletus associated with Convolvulus arvensis and Crepis foetida in the transmission of
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>Candidatus Phytoplasma solani
’‑
inflicted bois noir disease of grapevine in Serbia.Eur.J.Plant Pathol.,153:183
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195.Quaglino F(2019)Identification and ecology of alternative insect vectors of
‘
Candidatus Phytoplasma solani
’
to grapevine.Sci.Rep.,9:19522.]。自从新菠萝灰粉蚧入侵我国以来，国内关于新菠萝灰粉蚧研究主要集中风险性分析[覃振强(2010)外来入侵害虫新菠萝灰粉蚧在中国的风险性分析.中国农业科学，43(3)：626
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631],潜在地理分布[傅辽(2012)新菠萝灰粉蚧在中国目前及未来的潜在地理分布研究.植物检疫，26(4)：1
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5.]、不同寄主、温度对其生长发育与繁殖的影响[胡钟予(2017)温度对新菠萝灰粉蚧生长发育和繁殖的影响.应用生态学报，28(2):651
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657.)、天敌利用[赵家流(2015)丽草蛉生物学特性与防控新菠萝灰粉蚧效果研究.安徽农业科学，43(30):14
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16，19.]、分子鉴定[马光昌(2017)快速鉴定新菠萝灰粉蚧的分子标记技术.环境昆虫学报，39(4):893
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897.]；黄蓬英(2017)利用28SrDNA种特异引物鉴定新菠萝灰粉蚧.应用昆虫学报，54(4)：646
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651.]、防控药剂[莫秀芳(2019)新烟碱类杀虫剂对新菠萝灰粉蚧的毒力.环境昆虫学报，2019，41(6):1375－1379.]等方面做了许多工作。而关于新菠萝灰粉蚧作为植原体传播媒介的相关方法研究国内外仍未见报道。正是因如此，严重阻碍了抗紫色卷叶病剑麻品种的筛选、鉴定、评价，以及培育等一系列的工作。因此，建立一种操作性强、效率高、结果可靠的剑麻紫色卷叶病相关媒介传播方法，对于深入研究剑麻紫色卷叶病相关植原体的致病机理，阐明剑麻
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植原体
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新菠萝灰粉蚧互作机制，以及开展抗紫色卷叶病剑麻种质筛选、鉴定、评价等研究工作是必不可少的。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法。
[0007]多年的调查发现，新菠萝灰粉蚧的暴发与紫色卷叶病的发生存在明显的相关性，一般新菠萝灰粉蚧暴发的麻区常伴有紫色卷叶病的大面积流行，而新菠萝灰粉蚧控制较好的麻区则很少发生。经本研究组研究证实植原体为剑麻紫色卷叶病病原，新菠萝灰粉蚧则为其传播媒介。
[0008]基于此，本专利技术提供的一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法，包括如下步骤：
[0009](1)无植原体的健康剑麻苗的筛选：于无紫色卷叶病的剑麻苗圃选择株高25
‑
30cm
的剑麻小苗，于网室内隔离种植；待植株定植后，取同一植株的根、茎、叶组织按等质量比例混合为一个样品，进行DNA提取，利用特异性巢式PCR方法检测，筛选出无植原体的健康剑麻苗；
[0010](2)不携带植原体的新菠萝灰粉蚧的获得：从剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的叶片，置于南瓜表面，28
±
1℃室内恒温，让新菠萝灰粉蚧从剑麻叶片自主迁移到南瓜表面取食，待粉蚧全部迁移完后，清除剑麻叶片组织块，经南瓜饲养新菠萝灰粉蚧繁殖3代后可获得不携带植原体的新菠萝灰粉蚧；
[0011](3)携带植原体新菠萝灰粉蚧的获得：从待传媒发病剑麻植株叶片基随机选取部分新菠萝灰粉蚧，提取DNA并经特异性巢式PCR方法检测后，确认携带植原体即可；
[0012](4)接种新菠萝灰粉蚧：从待传媒发病剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的剑麻叶片组织块，置于步骤(1)中获得的无植原体的健康剑麻苗叶片基部处；于外面罩上纱网(250目)的铁架内(长
×
宽
×
高＝90cm
×
60cm
×
60cm)生长培养，让新菠萝灰粉蚧从剑麻叶片组织块自主迁移到剑麻植株基部取食，一周后清除接种剑麻叶块，培养4～6个月；同时设置健康对照和阴性对照；健康对照组为不接种新菠萝灰粉蚧的无菌健康剑麻。阴性对照组则为剪取步骤(2)中经南瓜脱毒繁殖4代时布满新菠萝灰粉蚧的南瓜表皮组织块(厚度1cm)的2～3龄若虫，置于步骤(1)获得的健康剑麻苗叶片基部处；罩网隔离培养；一周后清除接种南瓜表皮组织块，隔离培养4～6个月。
[0013]接种4个月后，接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的健康剑麻植株开始零星发病；至接种第5个月时，在接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的27株剑麻苗中，有24株剑麻叶片自叶尖变紫并卷叶症状；至接种第6个月时，在接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的剑麻植株发病叶片前1/2部位均出现退绿黄斑。而健康对照组与阴性对照组则均未发病。经特异性巢式PCR方法检测，只有接种携带植原体的新菠萝灰粉蚧的健康剑麻植株组检测为阳性，即为由新菠萝灰粉蚧介导传播后获得携带植原体的剑麻植株。
[0014]所述方法中，巢式PCR检测的引物如下：
[0015]第一轮扩增正向引物AGF：CTGGAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种感染剑麻紫色卷叶病相关植原体的媒介方法，包括如下步骤：(1)无植原体健康剑麻苗的筛选：于无紫色卷叶病的剑麻苗圃选择株高25
‑
30cm的剑麻小苗，于网室内隔离种植；待植株定植后，取同一植株的根、茎、叶组织等质量比例混合为一个样品，进行DNA提取，利用特异性巢式PCR方法检测，筛选出无植原体的健康剑麻苗；(2)不携带植原体新菠萝灰粉蚧的获得：从剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的叶片，置于南瓜表面，28
±
1℃室内恒温，让新菠萝灰粉蚧从剑麻叶基部自主迁移到南瓜表面取食，待粉蚧全部迁移完后，清除剑麻叶片组织块，经南瓜饲养新菠萝灰粉蚧繁殖3代后可获得不携带植原体的脱毒新菠萝灰粉蚧；(3)携带植原体新菠萝灰粉蚧的获得：从待传媒发病剑麻植株叶片基部随机选取部分新菠萝灰粉蚧，提取DNA并经特异性巢式PCR方法检测，确认携带有植原体；(4)接种新菠萝灰粉蚧与培养：从步骤(3)中经特异性巢式PCR方法检测确认携带有植原体的待传媒发病剑麻植株叶片基部剪取布满新菠萝灰粉蚧的叶片组织块，置于步骤(1)获得的健康剑麻苗叶片基部处，罩网隔离培养观察，让新菠萝灰粉蚧从南瓜表面自主迁移至剑麻叶基部取食；一周后清除接种剑麻叶片；隔离培养4～6个月；同时设置健康对照和阴性对照组；健康对照组为不接种新菠萝灰粉蚧的无菌健康剑麻；阴性对照组为割取步骤(2)中经南瓜脱毒繁殖4代时布满新菠萝灰粉蚧的南瓜表皮组织块的2～3龄若...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴伟怀，王桂花，易克贤，习金根，陈河龙，谭施北，梁艳琼，贺春萍，黄兴，刘志军，陆英，李锐，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：