棕榈酸在抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性中的用途制造技术

本发明专利技术属于微生物防控制剂领域，具体公开了棕榈酸在抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性的用途。本发明专利技术通过实验表明，棕榈酸对碱性丝氨酸蛋白酶活性有较好的抑制效果，因此棕榈酸可用作溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶抑制剂。本发明专利技术为棕榈酸开辟了新的用途，将其用于溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶抑制剂，为溶藻弧菌治疗提供了新的候选制剂；在临床溶藻弧菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，使抗溶藻弧菌抑制剂恢复对耐药溶藻弧菌的作用，从而为海水养殖业节省经济费用，减少其他抑制剂的毒副作用。作用。作用。

【技术实现步骤摘要】
棕榈酸在抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性中的用途


[0001]本专利技术属于微生物防控制剂领域，具体涉及棕榈酸在抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性的用途。

技术介绍

[0002]溶藻弧菌是常见的水产养殖病原菌，可感染多种海洋生物，具有高传播性、高致病性及高度耐药性等特点。近年来，海水养殖业遭受了由溶藻弧菌引起的重大经济损失。因此，研究溶藻弧菌的致病机制尤为重要，其中碱性丝氨酸蛋白酶是溶藻弧菌体内一种重要的毒力因子。现如今，抗生素是防治溶藻弧菌的主要手段，但抗生素滥用造成了严重的环境污染及耐药菌株的出现，因此急需要一种新型无毒无害的天然抑制剂。

技术实现思路

[0003]碱性丝氨酸蛋白酶是溶藻弧菌重要的毒力因子。本专利技术的目的在于提供一种棕榈酸在抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性中的用途。
[0004]本专利技术是通过以下技术方案来实现：本专利技术公开了棕榈酸在抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性中的用途。
[0005]优选地，所述的溶藻弧菌为溶藻弧菌EPGS，菌种保藏号为 CCTCC No. AB209306。
[0006]优选地，所述抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性，以达成削弱溶藻弧菌致毒能力的功效。
[0007]优选地，由棕榈酸与无水乙醇（浓度大于99.5%）配置成10 mg/mL的储备液，于4℃保存备用。
[0008]优选地，棕榈酸在浓度为1/8 MIC~1/2 MIC（MIC= 0.6 mg/mL）范围内，对溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性具有显著的抑制作用。r/>[0009]与现有抑制剂相比，本专利技术具有以下有益的抑制效果：本专利技术为棕榈酸开辟了新的用途，将其用于抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性包括减弱溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性，为抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶提供了新的候选抑制剂，在临床溶藻弧菌耐药性日趋普遍及耐药程度日趋严重的情况下，使抗溶藻弧菌抑制剂恢复对耐药溶藻弧菌的作用，从而为海水养殖业节省经济费用，减少其他抑制剂的毒副作用。
[0010]本专利技术通过检测棕榈酸抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性实验，表明棕榈酸对溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶具有较强的抑制作用，当加入棕榈酸后能明显抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶的活性，从而降低溶藻弧菌的致病能力。因此可将棕榈酸用作抗溶藻弧菌制剂。
附图说明
[0011]图1棕榈酸对溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性的影响图（“**”表示三个实验组分
别与对照组之间的显著性p＜0.01）。
具体实施方式
[0012]下面结合具体的实施方式对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。
实施例
[0013]1、原料：棕榈酸（CAS号为57
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10
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3，Sigma
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Aldrich）：购买于上海泰坦科技股份有限公司；无水乙醇：购买于天津市天力化学试剂有限公司；各试药置于4℃保存。实验前取出，充分混匀后进行检验。
[0014]2、菌株本研究所用的菌株为溶藻弧菌EPGS（菌种保藏号 CCTCC No. AB209306），由华东理工大学阿华生物工程研究所提供，溶藻弧菌长期储存于
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80℃。
[0015]3、培养基LBS液体培养基：（3%（w/v）NaCl，1%（w/v）Tryptone，0.5%（w/v）Yeast Extract）混合于水溶液中，高压灭菌（121℃，20min），于4℃保存备用。
[0016]4、仪器设备LRH
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250生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；ZD
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85气浴恒温振荡器（常州金坛良友仪器有限公司）；SW
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CJ
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IFD单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；5、棕榈酸储备液棕榈酸溶解于无水乙醇中，配置成浓度为10 mg/mL的储备液，于4℃保存备用。
[0017]6、菌液制备实验时取菌种1%的接种量接种于LBS培养基，加入0.1%（v/v）的氨苄青霉素，于200 r/min，30℃条件下活化复苏培养12 h，使菌液最终浓度约为108~10
9 CFU/mL备用（4℃保存），本专利技术中所有检验操作前，溶藻弧菌均作此上活化培养。
[0018]7、药敏板制备本专利技术采用二倍稀释法对棕榈酸扰动溶藻弧菌的MIC进行测定，具体操作如下：加入不同毫升数的棕榈酸储备液至LBS培养基中，使棕榈酸最终的浓度为CK（以加5uL无水乙醇作为对照组）、0.0375 mg/mL、0.075 mg/mL、0.15 mg/mL、0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、1.2 mg/mL，再按1%（v/v）接种量接入活化后的溶藻弧菌摇匀，将含有棕榈酸的LBS菌悬液移植24孔板中，同时以不含棕榈酸的菌悬液作为本实验的对照组。将24孔板置于30℃培养箱恒温培养。
[0019]在30℃恒温培养箱中，溶藻弧菌培养24 h后，观察菌体生长情况。以培养液澄清、肉眼不可见菌体时所加入的棕榈酸最低浓度即为棕榈酸对溶藻弧菌的MIC。上述实验均平行操作3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。实验结果得出：棕榈酸对溶藻弧菌的MIC为0.6 mg/mL。
[0020]8、亚抑菌浓度棕榈酸对溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性的影响经7所得MIC，本专利技术于棕榈酸低剂量棕榈酸浓度1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC的实验组及不加棕榈酸CK的对照组下，对溶藻弧菌的碱性丝氨酸蛋白酶活性进行检测。
[0021]碱性丝氨酸蛋白酶（Asp）是溶藻弧菌主要的胞外毒力蛋白，其活性通过天蓝色皮粉（Hide powder azure，HPA）底物的反应进行定量检测。
[0022]取30℃下培养9h至对数生长末期二级活化菌种培养液1.5mL到EP管中，12000rpm/min离心1min，移取1mL上清到含有 0.01g HPA、1mL PBS 培养瓶中，37℃，200r/min反应2h，12000rpm/min离心1min，取上清拍照并在600nm波长测定上清的吸光值。
[0023]结果见图1，经棕榈酸处理的实验组中，Asp的活性有较明显的降低趋势，且降低趋势与棕榈酸的浓度呈负相关性变化。此结果表明：棕榈酸严重抑制了溶藻弧菌Asp的活性。
[0024]本专利技术通过实验表明，溶藻弧菌在棕榈酸亚抑菌浓度1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC时，其碱性丝氨酸蛋白活性相对对照组，分别下降59.38%、84.37%、90.63%，结果显示棕榈酸对溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性具有显著的抑制作用。
[0025]综上所述，本专利技术通过实验表明，棕榈酸对溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性有较好的抑制效果，因此棕榈酸可用作防治溶藻弧菌病害的制剂。本专利技术为棕榈酸开辟了新的用途，可将其用作防治溶藻弧菌病害的抑制剂，为海水养殖业提供新的防治候本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.棕榈酸在抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性中的用途。2.根据权利要求1所述的棕榈酸在抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性中的用途，其特征在于，所述溶藻弧菌为溶藻弧菌EPGS，菌种保藏号为CCTCC No. AB209306。3.根据权利要求1所述的棕榈酸在抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性中的用途，其特征在于，所述棕榈酸通过抑制溶藻弧菌碱性丝氨酸蛋白酶活性，以达成削弱溶藻弧菌致毒能力的功效。...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵燕妮，韩洁，刘欢，周宁宁，周闯，武若冰，余瑞，张森虎，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：