牙鲆黏蛋白Muc5AC特异性抗体制备及应用制造技术

本发明专利技术提供一种牙鲆黏蛋白Muc5AC的特异性抗体及其制备与应用方法，所提供的牙鲆Muc5AC特异性抗体可用于检测牙鲆Muc5AC及其阳性黏液细胞，为研究牙鲆黏液细胞与黏蛋白特性及其黏膜免疫防御机制提供关键工具。本发明专利技术筛选获得了牙鲆黏蛋白Muc5AC基因的B细胞抗原表位STTEKVKTTESPKST，偶联KLH后免疫Balb/c小鼠，从而制备了牙鲆Muc5AC特异性抗体，为检测牙鲆Muc5AC蛋白分子及其阳性黏液细胞提供了重要工具。重要工具。重要工具。

【技术实现步骤摘要】
牙鲆黏蛋白Muc5AC特异性抗体制备及应用


[0001]本专利技术属于鱼类免疫学
，具体涉及一种牙鲆(Paralichthys olivaceus)黏蛋白Muc5AC的特异性抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]鱼类黏膜表面的上皮组织、黏液以及栖息的共生微生物构成了阻隔病原侵染的黏膜屏障，是鱼体抵御病原入侵的第一道防线。黏液层覆盖鱼类上皮层并与外界直接接触，形成动态保护结构，对于外环境变化、物理干扰以及免疫刺激可产生积极的免疫响应。鱼类黏液中包含广泛的天然免疫因子，发挥着独特的物理和化学屏障功能。其中，由黏液细胞分泌的黏蛋白是黏液最主要的组成部分，主要分为胶形成型黏蛋白和跨膜型黏蛋白。以Muc5AC为代表的胶形成型黏蛋白是维持黏膜稳态的关键分子，可固着免疫活性分子，参与炎症、修复或愈合反应。Muc5AC含有抗原配体的糖链，可作为许多共生菌理想的结合位点，通过有益菌与病原菌竞争，抑制感染并清除病原。因此，黏蛋白Muc5AC基因结构解析，有助于其功能研究及人工合成黏蛋白药物/疫苗的设计开发。但是，黏蛋白基因的核酸序列长、存在多个串联重复序列，使基因克隆成为黏蛋白研究的难点之一。目前仅少数硬骨鱼黏蛋白基因被描述，且为部分cDNA片段，在NCBI数据库中多数黏液蛋白仅提供了预测序列。另外，由于鱼类黏蛋白特异性标记探针的缺乏，鱼类黏蛋白研究局限于黏液高分子糖链，对黏液细胞的研究局限于阿利新蓝染色(AB staining)、过碘酸雪夫染色(AB
‑
PAS staining)等传统染色方法下的形态学研究。关于鱼类黏蛋白Muc5AC基因克隆和表达分析的资料缺乏，在蛋白层面的功能研究仍属空白。
[0003]哺乳动物中研究发现黏蛋白的过度或异位表达与很多疾病相关，常被用于疾病诊断或鉴别诊断，而重组表达的黏蛋白片段可以作为疫苗用于治疗，比如用于抗肿瘤疫苗的小黏蛋白肽，也可作为免疫调节剂等。鱼类中研究发现，病原感染后黏液分泌量增加，但是有关黏蛋白在鱼类疾病防治中的应用研究还很匮乏。因此，重组表达黏蛋白基因，解析黏蛋白结构特点，并研制高效的黏蛋白特异性抗体至关重要。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的经济鱼类，但病害问题给牙鲆产业造成重大经济损失。克隆表达牙鲆Muc5AC基因，获得重组表达蛋白，并制备特异性抗体，有助于在基因和蛋白水平研究不同病原和免疫原刺激下黏蛋白和黏液细胞的应答动态变化，挖掘黏蛋白Muc5AC在疾病防治和免疫防御中的应用潜力，为深入理解鱼类黏膜免疫防御机制以及黏膜疫苗研制提供有力支撑。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种牙鲆黏蛋白Muc5AC的特异性抗体及其制备方法和应用，所提供的特异性抗体可用于标记牙鲆黏蛋白Muc5AC及其阳性黏液细胞，为研究牙鲆黏液细胞与黏蛋白特性提供关键探针，为解析牙鲆黏膜免疫防御机制提供高效的免疫学试剂。
[0005]本专利技术提供一种用于制备牙鲆Muc5AC特异性抗体的B细胞抗原表位多肽，其具体的氨基酸序列为STTEKVKTTESPKST(SEQ IDNO:1)。
[0006]本专利技术还保护所提供的抗原表位多肽在制备鱼类黏蛋白疫苗或免疫调节剂中的应用；
[0007]本专利技术还保护上述的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的B细胞抗原表位多肽的衍生多肽，即通过取代、缺失、添加一个或几个氨基酸所获得的多肽；
[0008]本专利技术还保护一种偶联蛋白，是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的B细胞抗原表位多肽的5
′
端或3
′
端偶联有用于增强免疫效果的功能性分子；
[0009]作为实施例的一种具体记载，所述的功能性分子为KLH(血蓝蛋白)载体；
[0010]本专利技术还提供一种特异性抗体，所述的特异性抗体是使用上述的抗原多肽免疫动物制备的；
[0011]所述的动物，作为实施例的具体记载，为Balb/c小鼠；
[0012]本专利技术中特异性抗体的制备方法，是将牙鲆Muc5AC的B细胞抗原表位与载体偶联后，免疫Balb/c小鼠，取血清后处理得到抗牙鲆Muc5AC特异性抗体。
[0013]所述的载体，作为一个实施例的具体记载，为KLH(血蓝蛋白)载体；
[0014]本专利技术所提供的牙鲆Muc5AC分子的特异性抗体在制备牙鲆黏蛋白Muc5AC鉴定试剂中的应用。
[0015]本专利技术所提供的抗牙鲆Muc5AC分子的特异性抗体在制备Muc5AC阳性黏液细胞免疫应答研究试剂中的应用。
[0016]本专利技术还提供一种在石蜡或冰冻切片中检测或示踪牙鲆Muc5AC及其阳性黏液细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
[0017]1)抗原修复液(0.01M柠檬酸钠缓冲液，pH6.0)，用于在高温环境下打开醛类与抗原决定簇之间形成的交联键，从而暴露抗原表位；
[0018]2)5％牛血清白蛋白(BSA)封闭液(0.01M PBS配制)，用于封闭非特异性结合位点，以降低非特异性吸附；
[0019]3)抗牙鲆Muc5AC分子的特异性抗体(1:500，0.01M PBS稀释)，用于识别牙鲆黏膜组织中的Muc5AC阳性黏液细胞；
[0020]4)Cy3标记的羊抗鼠IgG抗体(1:1000，0.01M PBS稀释)，用于特异性识别Muc5AC特异性抗体，显示Muc5AC阳性黏液细胞；
[0021]5)DAPI(1:2000，0.01M PBS稀释)，用于细胞核染色。
[0022]所述0.01M柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中所含成分：3.8mL 0.1M柠檬酸溶液与16.2mL 0.1M柠檬酸钠缓冲液混合后加入蒸馏水至200mL；
[0023]所述0.01M PBS(1L，pH7.4)中所含成分：8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，HCl调节pH至7.4。
[0024]本专利技术克隆了牙鲆黏蛋白Muc5AC基因，筛选获得了牙鲆黏蛋白Muc5AC基因的B细胞抗原表位，并使用该抗原表位序列制备抗原制备了牙鲆黏蛋白Muc5AC的特异性抗体，为在基因和蛋白水平上检测牙鲆黏蛋白Muc5AC的表达变化提供了可能，为检测牙鲆Muc5AC阳性黏液细胞提供了关键工具，为黏蛋白疫苗/药物等研发提供了基础资料。本专利技术实现对Muc5AC阳性黏液细胞的鉴定及后续功能研究。
附图说明
[0025]图1：利用MEGA5.0软件以邻接法对Muc5AC分子构建系统进化树图；
[0026]图2：牙鲆Muc5AC的跨膜序列及信号肽序列分析图；
[0027]图3：牙鲆Muc5AC蛋白结构域分析图；
[0028]图4：牙鲆Muc5AC分子的PTS域序列图。
[0029]图5：IEDB软件预测分析的牙鲆Muc5AC的B细胞线性抗原表位预测图；
[0030]图6：牙鲆Muc5AC二级结构域图；
[0031]图7：DNAStar软件分析预测的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽，2)在1)的多肽上通过取代、缺失、添加一个或几个氨基酸所获得的多肽。2.一种偶联蛋白，其特征在于，所述的偶联蛋白是权利要求1所述的抗原多肽的5
′
端或3
′
端偶联有用于增强免疫效果的分子。3.如权利要求2所述的偶联蛋白，其特征在于，所述的分子为KLH载体蛋白。4.一种特异性抗体，其特征在于，所述的特异性抗体是使用权利要求1所述的抗原多肽或权利要求2所述的偶联蛋白免疫动物制备的。5.如权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：绳秀珍，王锦诚，高建亮，战文斌，唐小千，邢婧，迟恒，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：